骨髓间充质干细胞衰老调控的研究及单个细胞不对称分裂模型的建立

发布时间：2018-02-13 13:52

本文关键词： bMSCs S-bMSC 衰老不对称分裂单细胞测序　出处：《第二军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,b MSCs)由于其来源于自体,无致瘤性,免疫原性低等特点被应用于多种疾病的临床细胞治疗试验,但是在体外培养过程中,会发生复制性衰老现象,这种衰老不光伴随着增殖能力进行性的丧失,还伴有分化能力的丢失,已经成为b MSCs临床应用领域最大的瓶颈之一。同时,b MSCs又是一群异质性的细胞群,在分裂过程中会出现不对称分裂现象,由此导致的不均一性和不可预知性也阻碍了优化b MSCs潜能的研究。本研究一方面旨在通过对b MSCs群体的基因表达谱分析,找到发挥重要作用的衰老调控基因,另一方面则更希望通过对单个b MSC(S-b MSC)的培养,建立b MSCs不对称分裂的研究模型,并利用单细胞测序技术找到影响b MSCs不对称分裂,调控细胞衰老,鉴别b MSCs不同潜能的基因。第一部分:骨髓间充质干细胞衰老调控基因的研究方法:首先通过绘制细胞生长曲线、光镜下观察细胞形态、Ed U增殖实验、细胞周期负向调控因子的检测、β-Gal衰老实验、组蛋白H2A.X Ser139磷酸化水平的差异比较早晚代b MSCs增殖潜能的差异,确定晚代b MSCs的衰老表型。通过基因芯片检测具有较强增殖潜能且不易衰老的MAPCs的基因表达谱,与GEO数据库中b MSCs和ESCs的基因表达谱数据作比较,找出MAPCs中特异性表达的基因,利用半定量PCR法从这些基因中筛选出b MSCs自然传代(衰老)过程中呈渐变趋势的基因作为调控b MSCs衰老的候选基因DDR2。合成DDR2特异性的si RNA,转染入b MSCs中,观察细胞生长状态,通过CCK8法和Ed U增殖实验检测DDR2被抑制后b MSCs的增殖能力,利用β-Gal衰老实验、衰老标志物p16、h TERT的检测和DNA彗星实验检测DDR2被抑制后b MSCs的衰老表型和DNA损伤情况。合成CARM1特异性的si RNA,转染入b MSCs中,检测DDR2、p16和h TERT的表达水平的变化,观察细胞生长状态,利用β-Gal衰老实验检测细胞的衰老表型,通过过表达和补救实验确定CARM1是否是DDR2的上游调控分子。通过外源性上调b MSCs中CARM1和DDR2的水平,观察能否促进b MSCs的增殖。利用CARM1的抑制剂和染色体免疫共沉淀实验(Ch IP)验证CARM1是否通过修饰DDR2启动子区组蛋白H3R17的甲基化影响DDR2的表达。结果:晚代b MSCs细胞生长变缓,细胞形态变大伪足变长,无克隆生成,较早代b MSCs细胞增殖能力减弱,出现显著的衰老表型和DNA损伤。利用基因表达谱差异分析找到一组MAPCs中特异性表达的基因,验证了这些基因在b MSCs自然传代(衰老)过程中的表达趋势,找到候选基因DDR2,DDR2表达被抑制后细胞增殖能力减弱,出现较多的衰老细胞,H2A.X Ser139的磷酸化水平增高,DNA损伤加剧,p16水平上调,h TERT水平下调。CARM1表达被抑制后,p16水平上调,h TERT和DDR2的表达下调,b MSCs细胞出现衰老表型。过表达CARM1或DDR2并不能影响p16的水平,也不能促进b MSCs增殖。过表达CARM1可以上调DDR2的水平,加入CARM1特异性甲基化修饰的抑制剂以后DDR2水平下调,出现大量衰老细胞。CARM1在DDR2启动子区有富集,DDR2启动子区有H3R17的甲基化修饰,过表达和干扰CARM1均会影响H3R17的甲基化修饰的水平。结论:MAPCs具有特有的基因表达谱,晚代b MSCs细胞大量衰老,增殖能力显著下降,DDR2在b MSCs衰老调控中起关键作用,CARM1通过上调DDR2调控b MSCs衰老。外源性表达CARM1和DDR2作用有限,可以通过研究单个b MSC(S-b MSC)找到调控b MSCs不对称分裂和衰老的基因。第二部分:单个骨髓间充质干细胞不对称分裂模型的研究方法:将b MSCs从骨髓原代分离纯化后传代培养至P3代,利用活细胞示踪剂(CFSE)标记细胞,后将标记后的b MSCs细胞群消化成S-b MSC,通过贴壁培养和悬浮培养的方式研究b MSCs的不对称分裂。通过将标记后的S-b MSC按比例与未标记的脐带间充质干细胞(u MSCs)悬浮共培养,研究b MSC的不对称分裂。将未标记的S-b MSC单独悬浮培养,研究b MSC的不对称分裂。将上述三种方式培养的S-b MSC分裂后的单个子细胞消化分离并裂解保存,以备后续单细胞转录组扩增、建库、测序。结果:CFSE标记后的S-b MSC单独培养不会分裂,在与u MSCs共同培养后可出现分裂,并形成细胞团,但不适合后续研究。无标记的S-b MSC单独悬浮培养条件下除了2,4,8分裂相,还可出现3、5、6、7等非对数分裂相,对2、3、4细胞期各子细胞成功分离并保存。结论:S-b MSC在悬浮培养条件下可出现多种细胞期,研究同一细胞期之间的子细胞的基因表达差异为研究b MSCs不对称分裂提供了一个模型,研究不同细胞期之间的子细胞基因表达差异为研究b MSCs的增殖与衰老提供了一个模型。第三部分:单个骨髓间充质干细胞转录组扩增建库及表面标志物表达差异分析方法:将从2、3、4细胞期采集到的单个子细胞裂解,并利用3’末端poly A加尾法逆转录子细胞转录组的m RNA,通过两次PCR扩增和纯化获得各期子细胞的转录组c DNA。通过q PCR检测子细胞c DNA中b MSCs表面标志物的表达水平,确定子细胞的身份,比较这些表面标志物的表达差异,分析各期子细胞的异质性和潜能。将子细胞c DNA交予公司建库以备后续高通量测序分析。结果:成功扩增各细胞期子细胞转录组,各细胞期子细胞均表达阳性标志物CD90分子,均未表达阴性标志物分子,阳性标志物CD105分子在同一细胞期的子细胞之间有差异表达。阳性标志物CD73分子在4细胞期子细胞之间有差异表达。扩增的转录组c DNA达到建库要求,成功建库。结论:S-b MSC在分裂初期即出现不对称分裂现象,并会在之后的分裂中持续存在。b MSCs表面标志物的表达在S-b MSC分裂模型中呈现时空特异性的动态变化。后续对子细胞的高通量测序将揭示更多在不对称分裂和衰老过程中扮演重要作用的基因。
[Abstract]:Bone marrow - derived mesenchymal stem cells ( b MSCs ) have been used in clinical cell therapy of various diseases due to their origin , no genicity , low immunogenicity and so on . The expression level of DDR2 , p16 and h was detected by means of gene expression profiling . The expression of DDR2 , p16 and h was decreased , and the expression of DDR2 , p16 and h was decreased . In this paper , we studied the asymmetric division of b MSCs from 2 , 3 , 4 cell stages . The positive marker CD105 has a differential expression between the sub - cells of the same cell period . The positive marker CD73 has a differential expression between the 4 - cell sub - cells . Conclusion : The S - b MSC has asymmetric division during the initial division , and it will continue to exist in the later division . The expression of the surface marker of the MSCs can be dynamically changed in the S - b MSC division model . The high - throughput sequencing of the subsequent pairs will reveal more genes which play an important role in the process of asymmetric division and senescence .

【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2

【参考文献】