贝氏柯克斯体质粒生物学作用与功能研究

发布时间：2018-02-26 22:35

  本文关键词： 贝氏柯克斯体 QpH1质粒 穿梭载体 基因敲除　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,简称Cb)是一种革兰氏阴性、专性胞内寄生菌,是引起人类Q热的病原体[1-3]。Cb主要通过气溶胶[4]、蜱虫叮咬等途径,在人与动物之间进行传播,是已知的感染性最强的病原体之一,也是一种潜在的生物战剂[5]和生物恐怖剂[6]。研究发现:已知的Cb分离株中均含有一种质粒(QpH1[7]、QpRS[8]、QpDG[9]、QpDV[10,11])或者整合到Cb基因组的质粒同源序列(IPS[8,12]);Cb质粒编码多个IV型分泌系统效应蛋白[13,14],这些蛋白分泌到宿主细胞质后,参与调控细胞功能[15]。长期以来,Cb质粒(包括IPS)被认为可能是菌体生长或胞内寄生所需的关键因子,又或者可能跟Cb的环境耐受和所引起的疾病种类(急性Q热或慢性Q热)相关。由于培养困难及缺少Cb质粒的遗传操作方法,Cb质粒及其编码基因的生物学功能和致病机制均缺乏研究。近年来,无生命培养基ACCM[16,17]培养Cb方法的建立,推动了Cb的遗传学研究进展,为研究Cb基因的功能创造了机遇。本论文参考国外已有的Cb遗传操作方法[18,19],通过基因工程技术构建Cb穿梭载体,建立了Cb的遗传转化方法;利用质粒相似不兼容机制[20-22],成功构建了CbQg源质粒QpH1缺失突变体,并在体内、外对Cb质粒缺失突变体的表型和毒力变化等进行了初步的探讨;利用基因敲除和定点突变等技术,对CbQg源质粒QpH1的复制与分裂调控区进行了深入的探讨。第一章,基于E.coli质粒pMMB207[23],构建含RSF1010 ori的贝氏柯克斯体自主穿梭载体,建立贝氏柯克斯体转化系统。首先,利用PCR技术分别扩增绿色荧光蛋白基因(eGFP)、卡那霉素抗性基因(KanR)、Cb组成型表达基因启动子P311和P1169四段序列,以及含RSF1010 ori的载体骨架p207;然后,用融合PCR技术将四段序列融合为“P311-eGFP-P1169-KanR”串联序列;最后,用限制性核酸内切酶Kpn I和Xho I酶切“P311-eGFP-P1169-KanR”串联序列,连接至同样双酶切的载体骨架p207上,构建穿梭载体p207GK。将穿梭载体p207GK电转化至Cb Grita II相株,用无生命培养基ACCM-2进行连续传代培养,利用倒置荧光显微镜观察e GFP基因的表达,传代至eGFP基因高表达时,用单层半固体“ACCM-2/Kan/琼脂”平板克隆分纯Cb转化株;结果成功构建了自主的Cb穿梭载体,获得了稳定表达eGFP的Cb转化株,并完成了克隆分纯。表明我们成功建立了Cb遗传转化系统,为后续用遗传学方法研究Cb奠定了基础。第二章,生物信息学分析本室Cb Grita II相株质粒全长序列,确定该质粒为QpH1(GeneBank Accession No.AE016829),BLAST比对分析发现该质粒的CBUA0036~CBUA0039a序列片段在IPS中缺失,但在4种质粒(QpH1,QpRS,QpDG,QpDV)中存在且高度保守,推测该段序列可能是调控Cb质粒复制与分裂的功能区,包含复制起始位点序列和相关质粒分裂调控蛋白基因。利用PCR扩增技术,从质粒QpH1上扩增获得包含CBUA0036~CBUA0039a序列的片段,作为同源型质粒的骨架(命名为pQ);同时利用融合PCR扩增技术,使eGFP基因、KanR基因、P311和P1169启动子,以及p UC ori序列融合,形成“P311-eGFPP1169-KanR-pUC ori”串联序列;把串联序列亚克隆至载体骨架pQ上,构建新型穿梭载体p QGK。将新型穿梭载体pQGK电转化至Cb Grita II相菌中,用含Kan的无生命培养基ACCM-2进行连续传代培养,通过荧光显微镜进行观察。结果发现新型穿梭载体pQGK能在Cb中稳定地传代,荧光激发下使Cb转化菌呈现绿色荧光,这说明新型穿梭载体pQGK上的CBUA0036~CBUA0039a序列片段含有pQGK质粒的复制起始位点序列(ori)。对转化菌克隆分纯后,用QpH1质粒特异性引物对Cb克隆株进行PCR鉴定,未能检测到QpH1质粒,说明Cb克隆株中的QpH1质粒已经丢失,获得了CbQg源质粒QpH1缺失突变株Cb Grita II/p QGK;利用SYBR Green绝对定量Q-PCR技术分别测定Cb野生株中QpH1质粒和突变株Cb Grita II/pQGK中pQGK质粒的相对拷贝数,发现Qp H1与pQGK质粒都只有单拷贝;以上数据说明QpH1与pQGK质粒具有相同的复制与分裂调控机制,两者在Cb中不能共存,表明CBUA0036~CBUA0039a这段序列能严格地调控质粒QpH1的复制、分裂及相似不兼容。用Q-PCR技术测定突变株Cb Grita II/pQGK在细胞外(ACCM-2)和细胞内(BGM)的增殖能力,发现突变株和野生株无论是在囊泡形成与生长,还是在Cb菌体增殖方面,均无明显无差别,这结果提示Cb质粒QpH1的大部分序列(CBUA0001~CBUA0034a,85%)与Cb在胞内和胞外的正常生长无关。通过体内(SCID小鼠)和体外(THP-1细胞)实验发现突变株的毒力下降,提示QpH1质粒是Cb的一个毒力因子。第三章,以穿梭载体pQGK为基础,深入探索CBUA0036~CBUA0039a这段序列调控QpH1质粒复制和分裂的机制。通过基因敲除或序列删除的方法,对穿梭质粒pQGK上的CBUA0036~CBUA0039a这段序列进行不同程度地删减,构建一系列穿梭载体pQGK的突变体,命名为pQGK-D1~pQGK-D17。将这些穿梭载体分别电转化至Cb Grita II,用含Kan的ACCM-2培养基进行连续传代培养,通过荧光显微镜进行观察,当eGFP基因高表达时,对Cb转化菌进行克隆分纯;之后对Cb克隆株进行PCR鉴定分析。结果发现只有14个穿梭载体(pQGK-D1~pQGK-D14)能成功转化Cb并稳定传代;序列比较分析显示,只需含最短为600 bp的序列(介于CBUA0036和CBUA0037之间)即可使穿梭载体pQGK-D14在Cb内稳定地传代,而含更短序列片段的穿梭载体(pQGK-D15~pQGKD17)无法获得Cb转化菌,说明这段600 bp的序列包含Cb质粒QpH1的复制起始位点序列(ori)。随后对已经克隆分纯的Cb克隆菌进行PCR鉴定,发现穿梭载体pQGK-D1和pQGK-D5均能敲除Cb Grita II内源质粒QpH1;穿梭载体pQGK-D7~-D8、pQGK-D11~-D14与QpH1质粒共存,到目前为止,以上结果表明QpH1质粒的复制、分裂和相似不兼容,除了复制起始位点(ori)外,还受到其它未知因子的调控(实验进行中,详细结果待补充)。第四章,在前期研究的基础上,利用基因克隆技术,把穿梭载体pQGK上的KanR基因替换成RifR基因,构建新型穿梭载体pQGR,并电转化Cb Grita II及克隆分纯。在ACCM-2培养基中培养时,发现在相同时间内,pQGR转化株Cb Grita II/pQGR的增殖能力比pQGK转化株Cb Grita II/pQGK要明显下降;感染BGM后,结果发现在胞内只能形成细小的空泡,未能进一步发展成经典的大空泡,且Cb菌体增殖能力明显下降;感染THP-1细胞后,无空泡形成,亦未能检测到Cb菌体在细胞内增殖。上述结果说明,RifR基因的表达产物ADP-核糖基化酶在Cb内可能具有核糖基化作用,影响Cb正常的生物合成,使Cb减毒,对Cb感染细胞后空泡的发展和菌体增殖具有显著的抑制作用,表明RifR基因不适合作为Cb遗传转化研究中的药物筛选标记。综上所述,本研究成功构建了基于RSF1010 ori的自主穿梭载体p207GK,并利用该穿梭载体建立了Cb的遗传转化系统;随后,成功构建了与Cb质粒QpH1具有同源序列(CBUA0036~CBUA0039a)的新型穿梭质粒pQGK,并利用该穿梭载体成功敲除Cb内源质粒QpH1,获得QpH1质粒缺失突变体;对CBUA0036~CBUA0039a这段序列进行深入的研究后,发现QpH1质粒的复制起始位点序列区;此外,实验过程中还发现RifR基因编码产物ADP-核糖基化酶对Cb的生物合成具有显著的影响,不适合用来作为Cb遗传转化的药物筛选标记。本研究为进一步深入研究Cb质粒的生物学功能和致病机制提供新的遗传学工具和方法。
[Abstract]:Coxiella burnetii ( Cb ) is a Gram - negative , special intracellular parasitic fungus . It is a pathogen that causes the heat of human Q fever . It was found that each of the known Cb isolates contained a plasmid ( QpH1 - 7 , QpRS - 8 , QpDG - 9 , QpDV - 10 , 11 ) , or a plasmid - homologous sequence ( IPS - 8 , 12 kb ) integrated into the Cb genome ; the Cb - plasmid encodes a plurality of IV - type secretion system effectors 13 , 14 which , after being secreted into the host cell , participate in the regulation of the cellular function . In this paper , we have made a preliminary study on the genetic manipulation methods of Cb plasmid and its coding gene . In recent years , we have constructed the gene transformation method of the CbQg source plasmid QpH1 by genetic engineering technique . A novel shuttle vector pQGK was cloned into Cb Grita II / pQGK . It was found that only 14 shuttle vectors ( pQGK - D15 - pQGK - D14 ) were able to successfully transform Cb and stabilize the passages . The results showed that only 14 shuttle vectors ( pQGK - D15 - pQGKD17 ) could successfully transform Cb and stabilize passages . In conclusion , it was found that the pQGR gene was not suitable to be used as a drug screening marker in the study of Cb . In conclusion , it was found that the expression product ADP - ribosylase of the RifR gene had a significant effect on the biosynthesis of Cb , and it was not suitable to be used as a drug screening marker for Cb gene transformation .

【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R37;Q78

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 罗声栋;卢姗姗;胡燕;王涛;于永慧;冯乐;孙志会;宋立华;;贝氏柯克斯体穿梭载体构建及转化方法建立[J];生物技术通讯;2016年05期

2 王涛;宋立华;;贝氏柯克斯体的分子致病机理研究进展[J];中国人兽共患病学报;2015年09期

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本文编号：1539957