伯氏疏螺旋体毒力因子BmpA通过特定TLRs刺激THP-1细胞产生促炎趋化因子的研究

发布时间：2018-02-27 21:27

  本文关键词： 莱姆关节炎 伯氏疏螺旋体 rBmpA THP-1 TLR 趋化因子　出处：《昆明医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：[目的]以人单核巨噬细胞株(THP-1)为实验对象,探究伯氏疏螺旋体重组蛋白 A(recombinant Borrelia burgdorferi membrane protein A,rBmpA)刺激免疫细胞产生促炎趋化因子风暴是由何种Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)识别启动的。[方法]1、实验室构建的pGEX-6P1-bmpA重组大肠埃希菌在LB培养基中进行扩大培养,以0.1 mmol/L IPTG 37℃诱导培养6h,收集菌体超声破碎,离心收集含有GST-rBmpA的上清,利用Glutathione Sepharose 4B进行分离纯化得到目标蛋白,SDS-PAGE电泳分析。2、96孔细胞培养板培养THP-1细胞,佛波酯(PMA)的作用下诱导成熟为巨噬细胞,用TLR1、TLR2、TLR5、TLR6的中和抗体分别处理细胞,并设立对照组,然后加入rBmpA刺激培养24h,在24h时间点收集细胞培养上清,RayBiotech抗体芯片高通量检测细胞上清中38种趋化因子的分泌量。3、6孔细胞培养板培养THP-1细胞,PMA的作用下诱导成熟为巨噬细胞,加入rBmpA刺激培养20h,在0.5h、1h、5h、10h、20h的时间点使用Trizol试剂裂解细胞并收集细胞裂解液,通过QRT-PCR检测TLR1、TLR2、TLR5和TLR6基因的表达水平。4、6孔细胞培养板培养THP-1细胞,PMA的作用下诱导成熟为巨噬细胞,加入rBmpA刺激培养20h,在5h、10h、20h时间点使用RIPA裂解液裂解细胞并收集总蛋白裂解液,通过Western blotting检测TLR1、TLR2、TLR5和TLR6蛋白质的表达水平。[结果]1、与正常对照组相比,rBmpA刺激THP-1细胞培养后细胞上清中,RayBiotech抗体芯片检测的38种趋化因子中8种趋化因子分泌量增高。与rBmpA组相比,经TLR1中和抗体处理过的细胞培养后上清中,5种趋化因子分泌量降低;TLR2中和抗体处理过的细胞培养后上清中,7种趋化因子分泌量降低;TLR5中和抗体处理过的细胞培养后上清中,5种趋化因子分泌量增高:TLR6中和抗体处理过的细胞培养后上清中,6种趋化因子分泌量增高。2、rBmpA刺激THP-1细胞培养培养1h、5h、10h后细胞中TLR1、TLR2基因表达水平增高,TLR5、TLR6的基因表达水平无变化。3、rBmpA刺激THP-1细胞培养5h、10h、20h后细胞总蛋白裂解液中TLR1和TLR2的蛋白质表达水平增高,TLR5、TLR6的基因表达水平无变化。[结论]1.rBmpA刺激THP-1细胞后会导致THP-1细胞的8种趋化因子分泌量增高。2.TLR1、TLR2中和抗体封闭后再用rBmpA刺激THP-1细胞,趋化因子分泌量减少。TLR5、TLR6中和抗体封闭后再用rBmpA刺激THP-1细胞,趋化因子分泌量仍增高。3.rBmpA刺激THP-1细胞后会导致TLR1、TLR2基因表达量和蛋白质水平增高,TLR5、TLR6的基因表达量和蛋白质水平均无明显变化。4.rBmpA刺激细胞时,TLR1、TLR2表达增高,同时识别BmpA并激活免疫细胞产生促炎趋化因子风暴。
[Abstract]:[objective] to study human mononuclear macrophage cell line THP-1. To find out which Toll like receptor Toll-like receptor TLR was activated by recombinant Borrelia burgdorferi membrane protein AhrBmpA, a recombinant protein of Borrelia burgdorferi, which stimulates the production of pro-inflammatory chemokines in immune cells. [methods] 1Recombinant pGEX-6P1-bmpA recombinant Escherichia coli constructed in lab in LB. Expanded culture in the medium, The cells were cultured at 37 鈩，

本文编号：1544429