蚊抗药性相关基因转录组分析及功能验证

发布时间：2018-03-05 20:17

本文选题：淡色库蚊　切入点：溴氰菊酯　出处：《南京医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：蚊是重要的医学昆虫,能传播多种疾病,如疟疾、登革热、西尼罗河热、丝虫病、黄热病等。由于方便、高效和经济等特点,采用杀虫剂化学防制一直是蚊媒综合治理策略中的主要方法。然而,杀虫剂长期、大量地使用导致了蚊抗药性的发生和发展。抗药性已经成为蚊媒病防制工作中的最大障碍。对蚊抗药性相关基因的研究,最早采用功能克隆法(functional cloning strategy),主要是通过寻找杀虫剂的靶标位点或代谢相关的解毒酶类,随后再根据这些已知功能的蛋白质或酶类来克隆其相应编码基因。这种方法在单基因遗传性状研究中具有不可比拟的优势。其后,许多研究人员使用抑制性差减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)、基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression,SAGE)等方法,鉴定了一些其它蚊抗药性相关基因。然而,抗药性是多个基因、多重机制参与的复杂生物进化现象,没有某一个或一类已知基因能够完整阐明抗药性机制。全面系统寻找蚊抗药性相关基因并探寻其参与抗药性机制是蚊媒防制环节中亟待解决的问题。近年来,随着现代生物技术的发展,高通量转录组测序技术的出现使大规模筛选抗药性相关基因、从整体层面研究蚊抗药性成为可能。本课题以淡色库蚊(Culex pipiens pallens)实验室种群溴氰菊酯敏感(Laboratory Deltamethrin-Susceptible,Lab-DS)品系和抗性(Laboratory Deltamethrin-Resistant,Lab-DR)品系为实验材料。通过Illumina-Solexa高通量转录组测序(RNA-seq),比较了2个品系预混样本的基因表达情况。本次测序共检测到4961197620对碱基和55124418条reads,匹配到Vectorbase致倦库蚊(Culex pipiens quinquefasciatus)数据库后,组装成17679个已知基因。按照差异倍数大于2倍(|log2Ratio|≥1),且假阳性率(False Discovery Rate,FDR)小于0.001的标准,我们共筛选到1826个差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs),其中1078个基因在Lab-DR品系中高表达,748个基因在Lab-DR品系中低表达。这些DEGs包括细胞色素P450单加氧酶(p450s),表皮蛋白(cuticleproteins)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(udp-glucuronosyltransferases)、脂肪酶(lipases)、热休克蛋白(heatshockproteins)、酯酶(esterases)、丝氨酸蛋白酶(serineproteases)、肽酶(peptidases)、三磷酸腺苷结合盒转运体(atp-bindingcassettetransporters)等。随后,对这些degs进行了go(geneontology)功能和kegg(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes)通路显著性富集分析。结果提示,在degs中显著富集的go和kegg类别分别是代谢过程(metabolicprocess)和代谢通路(metabolicpathway)。同时,参照vectorbase致倦库蚊数据库,我们在lab-ds和lab-dr品系中分别优化了8315和8511个vectorbase致倦库蚊基因序列,并分别预测了4957和5048个新转录本(noveltranscriptunits,ntus)。为了证实rna-seq结果的可靠性,我们一方面采用实时荧光定量pcr(realtimefluorescentquantitative-polymerasechainreaction,qrt-pcr)对部分基因差异表达分析结果进行验证,结果证实,rna-seq和qrt-pcr两种方法得到的基因差异表达分析结果趋势一致;另一方面,我们随机选择部分新转录本进行反转录pcr(reversetranscriptionpcr,rt-pcr)验证,结果进一步证实了新转录本的真实存在。参考1826个degs的rpkm(readsperkilobasepermillionmappedreads)值及其在lab-ds和lab-dr品系间的差异倍数,我们最终选取了22个基因作为蚊抗药性相关候选基因。其中部分候选基因属于已知蚊抗药性相关基因家族,另一部分属于潜在新蚊抗药性相关基因。基于蚊媒病主要依靠雌蚊传播,我们使用qrt-pcr方法检测了这22个基因在实验室种群lab-ds和lab-dr品系淡色库蚊雌蚊中的相对表达水平。结果提示,其中4个基因(chymotrypsin-2,dimethylanilinemonooxygenase,carboxylesterase和venomallergen5)在lab-dr品系较lab-ds品系显著性高表达(p0.05)。随后利用商河(shanghe)和孤岛(gudao)两个现场种群标本进行检测。最终发现只有venomallergen5在实验室和两个现场种群的抗性品系较敏感品系显著性高表达(p0.05)。因此我们最终确定venomallergen5为后续功能验证候选基因。我们采用rt-pcr结合cdna末端快速扩增(rapidamplificationofcdnaend,race)技术进行候选基因全长扩增。结果表明,淡色库蚊venomallergen5基因序列全长912bp,包含开放阅读框(openreadingframe,orf)765bp,共编码254个氨基酸(genbank登录号:kf723295.1)。其推导的氨基酸序列与致倦库蚊(culexpipiensquinquefasciatus)、埃及伊蚊(aedesaegypti)、冈比亚按蚊(anophelesgambiae)、黑腹果蝇(drosophilamelanogaster)直系同源基因的一致性分别为100%、70.8%、43.85%和32.95%。淡色库蚊venomallergen5编码的蛋白包含一个scp样细胞外蛋白结构域(spermcoatingprotein-likeextracellularproteindomain),属于scp超家族。为了证实venomallergen5与蚊抗药性相关,我们随后进行了体外和体内功能验证。首先我们将外源性pib/v5-his-venomallergen5质粒dna转染入蚊细胞内,提高venomallergen5基因表达水平,用cck-8试剂盒检测不同浓度溴氰菊酯处理后蚊细胞的存活率,结果表明venomallergen5高表达能够显著降低蚊细胞对溴氰菊酯的敏感性(p0.05);在另一方面,我们将针对venomallergen5设计的sirna40显微注射入淡色库蚊雌蚊原体腔内,敲低venomallergen5基因表达水平,用who成蚊接触筒法检测0.05%溴氰菊酯药膜暴露后雌蚊的存活率,结果表明venomallergen5低表达能够显著增加雌蚊对溴氰菊酯的敏感性(p0.05)。这些结果表明,venomallergen5是一个新的蚊抗药性基因,值得我们进一步研究。我们检测了venomallergen5在四个不同溴氰菊酯抗性水平雌蚊品系中的相对表达水平。四个品系蚊的半数致死浓度(50%larvallethalconcentrations,lc50)分别为0.03、0.85、3.7和7.0mg/l。结果表明,venomallergen5在3个抗性品系中的基因表达水平分别是敏感品系的3.3、4.7和29.7倍(p0.05)。在现场检测结果中,venomallergen5基因表达水平在商河(shanghe)和孤岛(Gudao)现场种群抗性品系(resistant strain)较敏感品系(susceptible strain)显著性高表达(P0.05),差异倍数为60.58和7.34。这些结果提示,venom allergen 5有望成为蚊抗药性检测靶标。我们最后检测了venom allergen 5在不同发育阶段(卵、1-4龄幼虫、蛹和成蚊)淡色库蚊中的相对表达水平。结果表明,venom allergen 5在淡色库蚊所有发育阶段均表达。在卵、雌蚊和雄蚊阶段,venom allergen 5在Lab-DR品系中的基因表达水平分别是Lab-DS品系的2.24、3.3和12.3倍(P0.05)。本研究为蚊抗药性机制研究提供了重要分子基础,也为现场抗药性检测提供了大量候选基因;并证实venom allergen 5是一个新的蚊抗药性基因,有望成为蚊抗药性检测靶标。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R384.1

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