NKX2.1在ATRA诱导的神经管畸形发生过程中作用的初步研究

发布时间：2018-03-12 08:06

本文选题：神经管畸形　切入点：NKX2.1　出处：《山西医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:1.验证Nkx2.1基因在胚胎脑组织正常组和畸形组高通量转录组测序中的表达情况。2.通过全胚胎原位杂交技术确定Nkx2.1基因在小鼠胚胎组织中的时空表达定位。3.初步研究NKX2.1在ATRA诱导的神经管畸形发生过程中的作用机制。方法:1.通过在C57BL/6小鼠怀孕胚胎7.5天(E7.5)时,按照体重将一定剂量的全反式维甲酸(ATRA)以灌胃方式注入小鼠体内,建立小鼠胚胎神经管畸形(NTDs)的模型;继续饲养至E8.5、E9.5和E10.5时提取胚胎脑组织;2.通过实时定量聚合酶链式反应(real-time PCR)技术检测E8.5、E9.5和E10.5脑组织中正常组和畸形组Nkx2.1 mRNA水平的表达情况,对RNA测序结果进行验证;3.通过全胚胎原位杂交技术检测Nkx2.1在正常组和畸形组中E8.5、E9.5和E10.5的空间表达情况;4.通过使用脂质体将化学合成的小干扰RNA(siRNA)转染进Neuro-2a细胞干扰Nkx2.1的表达,将实验分为三组:空白对照组(未处理的正常对照组)、阴性对照组(不针对Nkx2.1序列的对照载体质粒转染组)和siRNA-Nkx2.1干扰组(针对Nkx2.1干扰载体质粒转染组),采用real-time PCR和Western blotting检测转染后Nkx2.1表达结果;5.通过Cell Counting Kit-8法(CCK-8法)检测阴性对照组和siRNA-Nkx2.1干扰组两组细胞增殖能力的变化情况;6.通过流式细胞术检测阴性对照组和sirna-nkx2.1干扰组两组细胞周期的变化情况;7.通过流式细胞术检测阴性对照组、sirna-nkx2.1-24h干扰组(nkx2.1干扰载体质粒转染24h)和sirna-nkx2.1-48h干扰组(nkx2.1干扰载体质粒转染48h)三组细胞凋亡的变化情况;8.通过活化的caspase3染色法,在荧光显微镜下观察阴性对照组、sirna-nkx2.1-24h干扰组和sirna-nkx2.1-48h干扰组三组细胞caspase3的激活情况;9.通过westernblotting检测shh及其下游ptch1、smo的蛋白水平的表达变化;10.统计学分析方法:数据用均数±标准差(x±s)表示,数据分析采用spss17.0软件,p0.05表示差异有统计学意义;数据作图使用graphpadprism5软件。结果:1.采用21mg/kg剂量的atra灌胃,成功建立了小鼠胚胎ntds的模型。通过real-timepcr技术检测e8.5、e9.5和e10.5脑组织中,nkx2.1在畸形组表达较正常组明显降低,下降倍数分别约为4倍、20倍、36倍,差异有统计学意义(p0.01);实验数据与rna测序结果一致。2.全胚胎原位杂交技术检测nkx2.1在e8.5正常组的前脑中有微弱表达,e9.5和e10.5在前脑、中脑和后脑各部位有明显表达;而在畸形组各部位几乎均无表达。3.脂质体转染nkx2.1小干扰片段进入neuro-2a细胞,nkx2.1在mrna和蛋白水平表达均降低。在mrna水平,空白对照组、阴性对照组和sirna-nkx2.1干扰组相对表达量分别为1.01±0.09、0.93±0.05和0.35±0.03,sirna-nkx2.1干扰组与空白对照组和阴性对照组比较,差异有统计学意义(p0.001);在蛋白质水平,空白对照组、阴性对照组和sirna-nkx2.1干扰组相对表达量分别为0.76±0.02、0.66±0.12和0.31±0.02,sirna-nkx2.1干扰组与空白对照组和阴性对照组比较,差异有统计学意义(p0.001)。4.CCK-8法结果得出,转染第1天和第2天,阴性对照组和siRNA-Nkx2.1干扰组两组OD值比较无统计学差异;转染3天后,siRNA-Nkx2.1干扰组的OD值较阴性对照组明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。5.流式结果显示,si RNA-Nkx2.1干扰组的细胞周期中G1期细胞的比例明显低于阴性对照组,阴性对照组和siRNA-Nkx2.1干扰组中G1期细胞的比例分别为(64.23±1.67)%和(49.31±2.51)%,差异有统计学意义(P0.01)。6.流式结果显示,siRNA-Nkx2.1干扰组的细胞凋亡率明显高于阴性对照组,且细胞凋亡随时间延长凋亡率逐渐增加;阴性对照组、siRNA-Nkx2.1-24 h干扰组和siRNA-Nkx2.1-48 h干扰组的总凋亡比例分别为(9.93±0.56)%、(12.93±0.63)%和(21.37±1.51)%,不同时间段的干扰组与对照组相比差异有统计学意义(P0.05)。7.活化的Caspase3荧光染色结果显示,与阴性对照组相比,siRNA-Nkx2.1干扰组的阳性细胞率提高,随时间延长Caspase3染色阳性细胞数逐渐增加;阴性对照组、siRNA-Nkx2.1-24 h干扰组和siRNA-Nkx2.1-48 h干扰组的Caspase3染色阳性细胞数分别为5.25±1.71、16.25±3.53和27.02±2.24,不同时间段的干扰组与对照组相比差异有统计学意义(P0.001)。8.Western blotting检测Shh、Ptch1和Smo蛋白水平,与阴性对照组相比,siRNA-Nkx2.1干扰组中Shh、Ptch1和Smo蛋白表达水平降低,各组差异有统计学意义(P0.01)。结论:1.转录因子NKX2.1表达降低可能在ATRA诱导的神经管畸形的发生中起重要作用。2.NKX2.1低表达可能通过参与Shh信号通路、通过影响细胞增殖降低和细胞凋亡增多而引起神经管畸形的发生。
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【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R321

【参考文献】