日本斑点热立克次体近缘株OmpB重组蛋白抗原性研究

发布时间：2018-03-15 07:09

本文选题：日本斑点热立克次体　切入点：OmpB重组蛋白　出处：《安徽医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：【研究背景】斑点热群立克次体被认为是一类分布广、危害大由蜱传播的人兽共患疾病。如由康氏立克次体引起的地中海斑点热,由立氏立克次体引起的落基山斑点热。斑点热的临床症状与普通的感冒相似,往往伴随着高烧,各种疼痛,恶心和呕吐,往往伴随皮疹,严重的患者时候可能出现中枢神经系统的症状。日本斑点热立克次体是日本科学家1984年发现的。1984年,5月到7月间,日本医生发现了三例患高热和皮疹的人,且三人都住在同一个乡村,在同一座山上的竹林里采集竹笋。其中两例具有焦痂,进行仔细观察分析,并通过一系列的血清学实验证明并非是恙虫病而是一种斑点热群立克次体,这种病被称为日本斑疹热。病原体是1985年首先从日本的四国岛地区分离出来,因其作为一种新的斑点热群立克次体,随后被命名为Rickettsia japonica。2000年前,我国关于斑点热立克次体研究主要在东北地区,证明不同的啮齿类动物携带黑龙江斑点热立克次体、西伯利亚斑点热立克次体和内蒙古斑点热立克次体3种病原体,同时也从患者血液中分离到黑龙江斑点热立克次体菌株。2000年后的十几年间,我国很少有相关斑点热立克次体病原学研究的报道。2013年我们团队在安徽省大别山区高热、头痛、全身斑丘疹的病人急性期血液标本中分离到一株日本斑点热立克次体近缘株,安徽120株(R.Japonica Anhui 120 strain),简称安徽120株,这是首次在我国发现的人感染日本斑点热立克次体。文献报道,斑点热立克次体体外培养在Vero细胞和L929细胞均能良好生长,但是我们团队分离到的这株菌不能在Vero和L929细胞中大量增殖,反而可在THP-1细胞(巨噬样细胞)中大量增殖。通过对这株菌的ompA、ompB、geneD、16SrRNA、17kD基因进行测序分析可知,OmpB基因扩增的基因片段在3170bp和3204bp发现存在2个单个碱基突变,在3297~3311处与日本斑点热立克次体株比较有连续15碱基的缺失。而ompb基因是日本斑点热立克次体菌的外膜蛋白,与细菌结合、入侵宿主细胞有关,因此我们考虑我们分离株的细胞嗜性可能与ompb基因连续15个碱基的缺失有关。因此,本文通过构建ompb原核表达质粒、重组蛋白表达、纯化以及抗原性的相关研究方面,为立克次体致病机制研究进行了一些基础的研究。【研究方法】(1)日本斑点热立克次体近缘株全菌多克隆抗体的制备:由本实验室保存的菌种去感染正常的thp-1细胞,待菌体在油镜下用diff-quick染色观察在细胞内的感染率约为100%时,取培养物去注射4只新西兰大白兔,共注射四次,每周一次,结束后采集兔心脏血,无菌分装后,保存于-80℃冰箱。(2)ompb重组蛋白表达与纯化:将ompb基因中特殊的一段通过t4连接酶连接至pet-30a载体后,用iptg诱导这段ompb基因的表达,利用sds-page和western-blot(wb)对重组蛋白ompb的反应原性进行鉴定,然后分别通过亲和层析技术和变复性技术对重组蛋白ompb上清形式和包涵体形式进行纯化。(3)间接elisa体系的建立:利用棋盘滴定法,依次确定抗原的最佳包被浓度,最佳血清稀释浓度以及最佳酶标二抗浓度,并与已有的国际上标准的检测方法(美国focus公司立克次体igg免疫荧光试剂盒,产品编号为:if0100mg)对比分析判断该方法的特异性,敏感性,符合率,kappa值。【研究结果】(1)通过免疫新西兰大白兔,取得心脏血后无菌分装制备成日本斑点热立克次体多克隆抗体,if测得结果为强阳性;间接elisa方法测得兔多克隆抗体的效价为1:8000;(2)通过酶切和测序,成功的构建含ompb基因片段的重组质粒,纯化后用lowey法测得用载体pet-30a构建的重组蛋白浓度为4mg/ml。(3)成功的建立了ompb重组蛋白间接elisa方法的体系,并且该方法具有良好的特异性和敏感性,与与已有的国际上标准的检测方法(美国focus公司立克次体igg免疫荧光试剂盒,产品编号为:if0100mg)相比,两者的符合率为99.2%。【结论】(1)质粒高表达的OmpB重组蛋白具有很好的免疫反应性;(2)R.Japonica Anhui 120 strain OmpB重组蛋白建立的间接ELISA方法对临床病人血清样本和正常人血清样本的斑点热立克次体的IgG抗体检测,有较高的敏感度和特异度。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R376.3

【参考文献】