基于小鼠外感寒湿模型探讨外感寒湿伤脾机制的理论及实验研究

发布时间：2018-03-19 11:52

本文选题：外感寒湿　切入点：脾　出处：《湖北中医药大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:寒邪和湿邪共同致病,即为寒湿之邪。寒、湿之邪为阴邪,最易损伤阳气。从中医传统理论角度探讨外感寒湿致病的病因病机和治疗法则对外感寒湿致病的研究有着重要意义。本研究拟通过建立外感寒湿模型,探讨外感寒湿伤脾的致病机理和散寒祛湿法对外感寒湿的治疗作用。方法:1.理论研究:查阅相关文献,归纳总结寒邪、湿邪的致病特点,探讨外感寒湿致病伤脾的致病途径、病机和治法。2.实验研究:45只SPF级昆明小鼠适应性饲养1周后按体重随机分为3组:(1)正常对照组(下称正常组):昆明小鼠15只,常规室温(15-20℃)喂养。(2)外感寒湿组(下称模型组):昆明小鼠15只,连续7天每天中午12:00-16:00将小鼠置于温度为(4±0.5)℃、湿度为90%±2的人工气候箱中饲养4h,其余时间按常规室温饲养。按0.13ml/10g标准每天给予生理盐水灌胃。(3)药物组(下称治疗组):昆明小鼠15只,连续7天每天中午12:00-16:00将小鼠置于温度为(4±0.5)℃、湿度为90%±2的人工气候箱中饲养4h,其余时间按常规室温饲养,根据人与小鼠体表面积换算,按0.13ml/10g体重标准每天给予加减肾着汤灌胃。取血后颈椎脱臼处死存活动物。无菌条件下收集小鼠结肠粪便,留取小鼠小肠组织。观察小鼠生存状态、分析小鼠体重变化、平板计数肠道细菌,采用病理组织学观察小肠病理结构改变,采用免疫组织化学染色观察小肠AQP-4、PAR-2、MAPKp38蛋白表达情况,采用Bio-Plex悬液芯片技术检测血清il-4、il-6、il-10、il-11、tnf-α、ifn-γ细胞因子的表达,采用蛋白质免疫印迹(westernblotting)观察小肠aqp-4、par-2、mapkp38、nf-kb、myd88、tlr4蛋白表达。3结果3.1理论探讨外感寒湿的致病途径分析:寒邪、湿邪共同作用人体而致病,寒湿致病的症状表现,寒湿客表则恶寒,肢厥;阻于经络则全身关节冷痛浮肿,拘急;寒湿直中脾胃,阻滞气机,则见濡泻、呕逆、胸腹痞满。寒邪客内,阻滞气血津液的运行可致水湿内生,从而使原来单纯的寒证变成寒湿证;湿邪阻滞阳气日久,使阳气损伤,以致阳气不足,阳虚生内寒或素体阳虚感受湿邪,亦使单纯的湿证,变成寒湿之证。外感寒湿致病的病机分析:外感寒湿共同作用,寒伤脾阳,影响脾主运化功能;寒湿之邪进一步损伤肾阳,肾阳不足,则无力温煦脾阳,进而加剧寒湿;寒湿之邪进一步作用于人体,损伤一身之阳,阴阳痹阻、营卫不和、体表阳气不足,温养气化失常;寒湿之邪共同作用人体,易使气机不畅,影响脾胃气机,寒湿之邪郁阻三焦,水道不利。3.2实验结果小鼠一般状态观察:正常对照组小鼠口唇红润,耳朵、尾巴呈淡粉色,毛发顺滑有光泽,食量正常,体重逐渐增加,反应灵敏;模型组毛发食量减少,体重减轻,疏松粗糙、晦暗无光泽,同时出现趾(指)关节肿大、足背皮肤水肿、破溃、烦躁不安,撕咬打斗,肛周秽浊,大便不成形或稀便,呼吸粗重等外湿侵袭的症状,取材前模型组出现了精神萎靡,嗜卧,懒动,神疲,关节拘急等症状。治疗组症状较模型组有明显改善,介于正常组和模型组之间。小鼠体重组间比较结果:入组时,经统计学处理,各组小鼠体重组间比较无差异;实验结束时,正常组(30.42±1.72)小鼠体重高于模型组(25.64±1.29),经统计学处理,有显著性差异,p0.01。治疗组(27.26±1.17)小鼠体重高于模型组(25.64±1.29),经统计学处理,有显著性差异,p0.05。正常组(7.23±0.72)小鼠结肠段大肠杆菌计数低于模型组(8.49±0.71),经统计学处理,有显著性差异,p0.05;治疗组(7.24±0.36)小鼠大肠杆菌计数低于模型组(8.49±0.71),经统计学处理,有显著性差异,p0.05。正常组(6.23±0.94)小鼠结肠段乳酸杆菌计数高于模型组(4.66±0.41),经统计学处理,有显著性差异,p0.05。正常组(5.68±0.69)小鼠结肠段双歧杆菌计数高于模型组(4.99±0.47),经统计学处理,有显著性差异,p0.05。小鼠小肠组织病理学观察结果:光镜下观察发现正常组小鼠的肠黏膜结构完整,层次分明,肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰,染色鲜明,排列规则。模型组小鼠的肠黏膜结构损伤程度较重,小肠绒毛部分断裂,上皮细胞肿胀,肠黏膜下层有炎性细胞浸润。治疗组小鼠的肠黏膜结构损伤程度较模型组轻,小肠绒毛少部分断裂,上皮细胞肿胀,肠黏膜下层也伴见炎性细胞浸润。aqp-4、par-2、mapkp38蛋白iod值结果:正常组(20.99±2.84)、治疗组(17.71±0.77)的小肠aqp-4蛋白的iod值均明显高于模型组(14.7±1.48),经统计学处理,有显著性差异,p0.01或p0.05。正常组(8.62±1.55)、治疗组(13.22±1.19)的小肠par-2蛋白的iod值均明显低于模型组(16.76±1.21),经统计学处理,有显著性差异,p0.01。正常组(8.62±1.55)、治疗组(13.22±1.19)的小肠mapkp38蛋白的iod值均明显低于模型组(16.76±1.21),经统计学处理,有显著性差异,p0.01。小鼠血清细胞因子结果:正常组(166.95±85.56)血清il-4含量高于模型组(70.51±22.48),经统计学处理,有显著性差异,p0.05。正常组(26.11±14.33)血清il-6含量低于模型组(69.61±33.13),经统计学处理,有显著性差异,p0.05。正常组(73.23±26.17)血清il-10含量高于模型组(36.14±22.48),经统计学处理,有显著性差异,p0.05。正常组(51.43±25.35)、治疗组(80.59±34.91)血清ifn-γ含量低于模型组(138.19±58.81),经统计学处理,有显著性差异,p0.05。小鼠小肠组织aqp-4蛋白的表达,正常组(0.49±0.14)高于模型组(0.36±0.13),经统计学处理,有显著性差异,p0.05。蛋白免疫印迹结果:小鼠小肠组织par-2蛋白的表达,正常组(0.18±0.13)、治疗组(0.45±0.06)低于模型组(0.52±0.24),经统计学处理,有显著性差异,p0.05。小鼠小肠组织mapkp38蛋白的表达,正常组(0.12±0.08)、治疗组(0.29±0.15)低于模型组(0.45±0.12),经统计学处理,有显著性差异,p0.05。小鼠小肠组织nf-kb蛋白的表达,正常组(0.32±0.11)、治疗组(0.35±0.07)低于模型组(0.54±0.11),经统计学处理,有显著性差异,p0.05。小鼠小肠组织myd88蛋白的表达,正常组(0.09±0.08)低于模型组(0.32±0.12),经统计学处理,有显著性差异,p0.05。小鼠小肠组织tlr4蛋白的表达,正常组(0.21±0.10)低于模型组(0.44±0.16),经统计学处理,有显著性差异,p0.05。4.结论本研究从中医理论出发,结合寒邪、湿邪的致病特点,分析外感寒湿致病的病机是外感寒湿直接伤脾阳、外感寒湿进一步损伤肾阳、最终外感寒湿伤一身之阳,影响脾主运化功能和脾胃气机,导致体内水液代谢障碍、脾主运化功能失常等表现。对外感寒湿的治疗要从散寒祛湿立法。本研究成功建立了外感寒湿模型。模型组小鼠出现体重下降、肠道菌群失调、小肠炎性反应、组织结构紊乱、水液代谢障碍、免疫系统紊乱等多个方面的改变,符合外感寒湿致病的病理表现。模型组小鼠出现的肠道菌群紊乱、小肠炎性反应、组织结构紊乱等变化,可能是外感寒湿损伤脾阳,影响脾主运化功能的生物学基础之一。模型组小鼠出现的水液代谢异常,可能是外感寒湿损伤脾阳,阻滞脾胃气机、影响水液代谢的生物学基础之一。模型组小鼠出现的免疫系统紊乱可能是外感寒湿损伤脾阳甚至一身之阳,影响免疫机能的生物学基础之一。模型组小鼠上调TLR4/NF-κB信号通路的表达,可能是外感寒湿致病的分子机制之一。以散寒祛湿立法的加味肾着汤改善了模型组小鼠体重下降、肠道菌群失调、小肠炎性反应、组织结构紊乱、水液代谢障碍、免疫系统紊乱的状况,对TLR4/NF-κB信号通路的抑制作用,可能是散寒祛湿法立法立法的加味肾着汤治疗外感寒湿的重要分子机制之一。
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【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R254;R-332

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