WIP1对小鼠胚胎造血发育调控的异质性研究

发布时间：2018-03-21 00:34

本文选题：Wip1缺失　切入点：造血干细胞　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)发育调控是近年来实验血液学、再生医学、干细胞生物学和免疫学等多学科交叉研究的重点。造血干细胞移植可以给很多恶性血液病、淋巴瘤等其他某些实体肿瘤患者带来很好的疗效。造血干细胞来源有限且无法在体外大量有效扩增是限制其临床应用的主要瓶颈。深入探究造血干细胞发育规律将有助于体外诱导扩增可供使用的造血干细胞。然而,由于造血干细胞的发育涉及多个组织多个精密的分化阶段,对其中的相关机理探讨颇具科学意义。造血干细胞可以在受体内长期多谱系重建受损的造血系统。然而越来越多的研究表明每个造血干细胞都有各自不同的特征,具有异质性,这些不同体现在分化的谱系偏向、细胞增殖能力、细胞周期、自我更新能力的强弱、对信号调控的反应等多个方面。Wild-type(WT)p53-induced phosphatase 1(WIP1)是由Ppm1d基因编码的丝氨酸、苏氨酸磷酸酶,与PP2C磷酸酶家族成员具有高度的同源性。WIP1广泛分布于成体和胚胎组织,它具有多种生理功能,参与调控胸腺的稳态维持,参与早期T、B细胞和中性粒细胞的发育和成熟。WIP1在成体HSC中高表达,调控成体HSC的稳态维持和分化。Wip1敲除小鼠(Wip1-/-,KO)的骨髓、外周血、脾脏的B淋巴细胞数目较野生型(Wip1+/+,WT)明显减少,B细胞内p53持续激活,导致凋亡水平上调。Wip1-/-小鼠成体骨髓HSC表现衰老的表型,包括造血干细胞池扩大,造血重建活力减低,而删除p53可以挽救多系重建缺陷,但是不影响造血干细胞池的扩大,后者被证明与mTORC1介导的HSC增殖相关。然而,WIP1是否调控胚胎期造血干细胞的发育及其调控特点仍未知。本课题旨在利用Wip1基因敲除小鼠对WIP1在胚胎造血发育中的作用及其调控规律进行研究。首先,我们对Wip1缺失对胚胎期不同造血位点HSC发育的影响进行研究,包括胎肝、AGM区、卵黄囊、胎盘、头部的HSC的数目和功能。前期研究中发现,Wip1缺失小鼠胚胎大体外观较野生型小,胎肝发育体积较野生型小,Wip1缺失胎肝造血干细胞发育异常,表型HSC数目下降,HSC体内移植功能下降。AGM区作为HSC产生和成熟的重要位点,我们通过直接移植实验证明Wip1缺失胚胎AGM区几乎没有正常功能型的HSC。Wip1缺失卵黄囊、胎盘和头部直接移植,发现均有重建,但是较野生型比HSC的数目和功能有不同程度的受损,受损程度介乎胎肝和AGM区之间。因既往研究表明WIP1与增殖、细胞周期、凋亡相关,于是我们考察了Wip1-/-E12.5胎肝HSC的增殖、细胞周期和凋亡。取Wip1+/+和Wip1-/-E12.5胎肝的细胞,分别标记HSC的同时标记CD168考察增殖,标记Ki67/7-AAD考察周期,标记AnnexinV/7-AAD考察凋亡。和Wip1+/+相比,Wip1-/-HSC在增殖和周期上表现更活跃,凋亡有所增多。接下来我们考察Wip1缺失对小鼠胚胎AGM区pre-HSC的产生及功能的调控作用,主要分为体外体内两部分。体外主要是考察pre-HSC与基质细胞OP9-DL1共孵育移植过程中应用WIP1抑制剂CCT的影响。我们想先排除WIP1抑制剂对基质细胞的抑制作用,分别用DMSO(作对照)和CCT作用基质细胞OP9-DL1 48小时,考察OP9-DL1表面干性标志和其他造血相关标志包括Sca-1、CD44、CD31、CD45的变化情况,同时检测其增殖、凋亡,以上均未发现明显差异,说明WIP1抑制剂对基质细胞的功能状态无抑制。考察WIP1抑制剂CCT对单个pre-HSC体外孵育增殖的影响。流式分选E11.5 WT小鼠胚胎AGM单个的T1 pre-HSC(CD31+CD41lowCD45-c-Kit+CD201high)和T2pre-HSC(CD31+CD45+c-Kit+201high)体外孵育6天,实验组加CCT,对照组加DMSO,计数形成大、中、小型簇的数目。结果显示,无论对于T1 pre-HSC还是T2 pre-HSC,与对照组比CCT在体外均能明显抑制大型簇的形成,总体上对于T1 pre-HSC抑制更为明显,形成的小型簇比例更多。随后考察WIP1抑制剂CCT对T1 pre-HSC、T2 pre-HSC孵育移植的功能影响。我们分选出野生型(或CD45.1/CD45.2)胚胎的E11 AGM区包括T1pre-HSC(CD31+CD41+CD45-)和T2 pre-HSC(CD31+CD45+)的群体在体外孵育,孵育过程中用CCT处理(对照组用DMSO),孵育6天后移植,移植后1-4个月检测受体外周血嵌合率。具体移植重建结果:T1 pre-HSC对照组重建为6/7,实验组为0/7;T2 pre-HSC对照组为7/7,实验组为3/6。结果表明,CCT会严重抑制T1pre-HSC、T2 pre-HSC的体外孵育成熟,而对T1 pre-HSC较T2 pre-HSC的抑制更为明显。随后将Wip1-/-小鼠胚胎AGM区T1 pre-HSC、T2 pre-HSC孵育移植。我们将Wip1+/-与Wip1+/-小鼠交配,获得WT、HT、KO三种基因型的胚胎,分离E11 AGM区,流式分选包括T1 pre-HSC和T2 pre-HSC群体体外与OP9-DL1共培养6天后移植,采集外周血检测重建情况。通过移植后1-6个月外周血的数据采集,我们发现Wip1-/-胚胎T1 pre-HSC孵育移植可以检测到重建,且重建比例和嵌合率与野生型相近,说明T1 pre-HSC体外可以发育为功能基本正常的造血干细胞;而T2pre-HSC的孵育移植外周血嵌合率较野生型明显下降。上述结果表明,生理条件下,Wip1缺失胚胎AGM区可以产生功能较正常的T1 pre-HSC,体外孵育可以获得功能正常的HSC,但是WIP1体内持续缺失一旦形成T2 pre-HSC,孵育移植则有明显的功能缺陷。为了更充分的比较Wip1缺失与否对胚胎期的各位点的造血发育产生的影响,我们将目光放在了循环血上,而循环血中是否存在pre-HSC仍是未解之谜。于是我们对野生型小鼠E10(31-40sp)、E11(41-44sp)胚胎循环血细胞进行类似AGM区pre-HSC的分析和分选孵育移植实验,分别进行了4次、7次独立实验,分别检测了25只、80只受体,结果均未检测到重建。在现有的实验基础上,未能从功能移植实验检测到循环血pre-HSC。综合以上数据,我们的工作揭示了WIP1在小鼠胚胎重要的造血发育位点包括胎肝、AGM区、卵黄囊、胎盘、头部对造血干细胞发育调控都发挥着不同程度的重要作用,其中对AGM区HSC的形成及功能至关重要,对胎肝和卵黄囊、胎盘、头部影响较AGM不同程度减弱。我们首次发现WIP1对造血干细胞前体的调控作用,尤其是对T1 pre-HSC和T2 pre-HSC具有差异性调控作用,WIP1缺失不影响T1 pre-HSC形成及功能,但是WIP1持续缺失对于T1 pre-HSC的进一步成熟为HSC具有严重抑制作用。WIP1抑制剂CCT会严重抑制T1 pre-HSC、T2 pre-HSC的体外孵育成熟,而对T1 pre-HSC较T2 pre-HSC的抑制更为明显。关于WIP1对造血干细胞发育调控的相关研究使得我们对造血干细胞起源和本质有更深入的认识。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392

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