血管抑制因子Kringle 5体内结合蛋白的筛选及其相互作用研究

发布时间：2018-03-29 15:08

本文选题：Kringle　切入点：5　出处：《西北大学》2016年博士论文

【摘要】：Kringle 5是纤溶酶原的第五个片段,分子量约8KD,是Cao等于1977年通过蛋白酶消化人纤溶酶原和分子克隆的方法得到的。Kringle 5主要作用于血管内皮细胞,使血管内皮细胞生长周期停滞而导致血管内皮细胞凋亡,Kringle 5还能抑制血管内皮细胞的迁移。但Kringle 5对于其它细胞,如成纤维细胞、人干细胞等没有作用。虽然Kringle 5具有抑制血管内皮细胞增殖和分化的作用,对于治疗肿瘤具有重要的意义,但Kringle 5的作用靶点是什么?它是如何导致血管内皮细胞凋亡的?等等问题,到目前为止,还没有明确的答案。针对这种情况,本研究以原核表达的Kringle 5为靶蛋白筛选Kringle 5在体内的结合蛋白,并通过SPR和前沿色谱法确认了VDAC-1与Kringle 5的结合和相互作用。我们试图建立一种通过噬菌体肽库技术结合分子对接技术和SPR技术筛选蛋白体内结合蛋白的快速筛选系统,为Kringle 5体内结合蛋白的筛选和研究其抑制血管内皮细胞生长机理奠定基础。本研究主要取得了以下成果：(1) 根据NCBI数据库中人Kringle 5蛋白的基因序列设计引物扩增出Kringle 5基因,将其成功表达在pET28b原核表达载体中,并在BL21细胞中诱导表达。SDS-PAGE蛋白电泳分析发现,带有His标签的Kringle 5蛋白出现在破碎细胞上清液中。上清液经镍亲和柱分离后,得到纯度约为86%的重组Kringle 5蛋白。(2)以Kringle 5蛋白为靶蛋白,对噬菌体环7肽库进行筛选。4轮筛选后,噬菌体回收率从6.25×10~(-9)提高到了1.57×10~(-7),噬菌体得到富集。挑取噬菌体单克隆测序后发现,随机挑取的50个单克隆分别表达13个短肽,ELASA分析这13个短肽与Kringle5的亲和力,最终确定IGNSNTL为Kringle 5的高亲和短肽。以该短肽比对NCBI人源蛋白质数据库,共找到103种与该短肽同源性较高的蛋白。逐一比对分析这103种蛋白的氨基酸序列及功能,发现这些蛋白归属于28类。根据这28类蛋白的功能、作用以及它们在细胞内的作用途径和作用方式,初步认确定Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor等9种蛋白可能是Kringle 5蛋白的体内结合蛋白。根据Kringle 5在人体内的作用方式和作用途径推断,VDAC-1、Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor和ABCA12可能为Kringle 5蛋白的体内结合蛋白。(3)同源建模和直接建模的方式构建了Kringle 5及初步筛选的9种蛋白的晶体结构。HEX软件分析了Kringle 5蛋白与这9种蛋白的作用,分子对接结果发现Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和Protein C-ets-2与Kringle 5具有相对较低的结合自由能,其结合自由能分别为-837.55 J/mol、-822.65 J/mol和-832.6 J/mol.蛋白活性位点分析发现,Kringle 5与Protein C-ets-2作用时并没有进入它形成的活性口袋,但进入了Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1、ABCA12和Endothelin B receptor isoform X2形成的活性口袋中。分析Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、 VDAC-1、ABCA12和Endothelin B receptor isoform X2蛋白活性中心参与与Kringle 5作用的氨基酸,Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12活性中心参与对接的氨基酸多数出现在IGNSNTL筛选短肽中,说明IGNSNTL短肽较好地模拟了Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12蛋白的活性中心。根据化学反应能量最低原则和化学反应空间匹配原则,推断Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor和VDAC-1蛋白为Kringle 5蛋白的结合蛋白。(4)为了证明噬菌体展示技术筛选的9种蛋白能否与Kringle 5作用,明确分子对接技术在结合蛋白筛选中的作用,本部分构建了Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12等9种蛋白的原核表达载体,经诱导表达后,利用SPR技术分析了Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12等9种蛋白与Kringle 5蛋白的相互作用。SPR分析表明,除了VDAC-1蛋白,Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor和ABCA12等8种蛋白均不能与Kringle 5发生作用,表明VDAC-1是Kringle 5蛋白的体内结合蛋白。(5)根据NCBI中VDAC-1的基因序列,以pCMV6-XL5-VDAC-1为模版克隆了VDAC-1基因,构建了VDAC-1蛋白的原核表达载体pET28b-VDAC-1,并在BL21细胞中诱导表达成功。SDS-PAGE电泳分析发现VDAC-1蛋白以包涵体的形式表达。经变性复性后分离和柱上复性分离两种分离方法的分离后,变性复性后分离的分离方法蛋白产率高于柱上复性分离方法蛋白的产率。研究VDAC-1蛋白复性条件发现,当复性条件为溶液pH值8.0、氧化型谷胱甘肽浓度0.2 mmol/L、还原型谷胱甘肽的浓度1 mmol/L时VDAC-1蛋白的复性产率最高,蛋白产率可达55.6%。(6)优化Kringle 5在CM5芯片上的固定条件后,以该优化条件固定Kringle 5于CM芯片上,分析了VDAC-1与Kringle 5相互作用的热力学参数,结果表明,VDAC-1与Kringle 5的结合常数为2.43×e3 L/mol、解离常数为4.12×e-4L/mol。前沿色谱法进一步分析了Kringle 5与VDAC-1的相互作用,结果表明VDAC-1能与固定化的Kringle 5发生相互作用,其结合常数为23.54 L/mol,解离常数为0.097 L/mol。因此VDAC-1为Kringle 5的体内结合蛋白。本研究通过噬菌体展示肽库技术结合分子模拟对接技术筛选Kringle 5的体内结合蛋白,SPR证明该法能有效缩小Kringle 5结合蛋白的筛选范围,通过该法筛选的Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12蛋白中的VDAC-1蛋白经SPR与前沿色谱证明能与Kringle 5发生作用。因此以噬菌体展示肽库技术为基础结合分子模拟对接技术和SPR技术筛选靶蛋白体内结合蛋白的方法是有效和可行的。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R363

【参考文献】