清热、活血中药调控TLR4信号干预AS大鼠模型及AMI热毒证候病因的研究

发布时间：2018-03-30 16:51

本文选题：动脉粥样硬化　切入点：炎症刺激　出处：《广州中医药大学》2016年博士论文

【摘要】：第一部分实验研究一脂多糖慢性炎症刺激对大鼠AS模型的影响目的：本部分主要探讨反复肌肉注射脂多糖诱导慢性炎症反应对大鼠AS模型形成的影响及其可能的机制。在高脂饮食与腹腔注射维生素D3的传统AS大鼠模型基础上,通过定期肌肉注射不同剂量脂多糖模拟慢性感染性炎症过程,以三因素强化干预方式建立大鼠AS模型,观察脂多糖对AS大鼠主动脉斑块形成的影响以及血脂水平、炎症因子的变化,探讨一种快速、稳定、经济AS大鼠造模方式及其相关机制。方法：本实验通过定期肌肉注射脂多糖的方法在高脂饮食复合腹腔注射维生素D。的大鼠体内诱导一个持续性的慢性感染性炎症反应,以促进大鼠主动脉AS病变。根据处理因素不同分为4个组,每组8只大鼠(雄性SD大鼠,SPF级,180g-220g),具体分组为空白对照组(普通饮食)、模型组(高脂饮食+腹腔注射维生素D3)、低剂量组(模型组造模基础上+低剂量脂多糖注射)、高剂量组(模型组造模基础上+高剂量脂多糖注射)。在第10周实验结束后采用腹主动脉采血休克法处死动物留取标本,采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-6水平；采用酶比色法检测血脂CHOL、TG、HDL-C、LDL-C水平；胸主动脉标本组织行HE染色并在光镜下进行病理形态学观察及积分评价。结果：1.干预组以及模型组较空白对照组血清CHOL、TG、LDL-C水平明显升高(P0.05),提示高脂血症大鼠模型建立。低剂量组与模型组血脂水平差异不大,高剂量组与模型组相比,血清CHOL、LDL-C、TG水平明显升高(P0.05)；2.干预组以及模型组较空白对照血清TNF-a、IL-6水平明显升高(P0.05),提示脂多糖刺激后大鼠机体处于慢性炎症反应状态,在高脂复合腹腔注射维生素D3基础上给予不同剂量内毒素诱导可以诱导慢性炎症反应,提高血清TNF-a、IL-6等炎症因子水平,以高剂量组诱导炎症反应作用最为明显(P0.05)；3.主动脉HE染色,模型组可见血管内皮结构紊乱,内膜明显增厚,主动脉壁节段性硬化斑块,可见脂质斑块、泡沫样细胞以及钙质沉积,斑块向管腔内突起形成狭窄；低剂量组较模型组内膜增厚明显,内膜下泡沫细胞聚集伴有炎性细胞浸润,多处形成动脉粥样硬性斑块；高剂量组主动脉病变改变明显,血管内皮连续性受损害,内膜增厚,大量脂质斑块以及泡沫样细胞积聚,蓝色钙化病灶,炎症细胞局部浸润,动脉粥样斑块不稳定,部分斑块破裂出血,管腔内有混合性血栓,多处有动脉粥样斑块向管腔内突起管腔狭窄明显,主动脉染色等级积分高剂量组明显高于模型组(P0.05)。结论：1.高脂饮食+腹注维生素D3可使AS大鼠TC、TG、LDL-C水平升高,叠加不同剂量脂多糖注射的作用下可进一步协同提高TC、TG、LDL-C水平,以高剂量脂多糖组加重血脂代谢紊乱明显。2.高脂饮食+腹注维生素D3可使大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高,脂多糖刺激可加速这种炎症反应进程,进一步提高TNF-α、IL-6水平,以高剂量组效果最为明显；3.脂多糖促AS可能机制为促进炎症反应以及血脂代谢紊乱,炎症细胞大量释放激活后损伤血管内皮以及形成泡沫细胞吞噬脂质,加剧脂质氧化代谢紊乱以及脂质沉积从而进一步促进AS斑块形成或斑块不稳定。第二部分实验研究二清热、活血中药对AS大鼠的血脂、炎症因子水平以及TLR4相关信号通路影响的实验研究目的：通过高脂饮食联合维生素D3、脂多糖注射建立大鼠AS模型,选用清热、活血中药双黄连、丹参多酚酸盐注射液干预复合因素所致的大鼠AS模型,从血脂,IL-6、TNF-α、P-selectin,主动脉病理形态改变比较两者的疗效,同时从TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨双黄连以及丹参多酚酸盐干预AS的可能机制,为清热、活血法治疗AS及其相关疾病提供基础依据。方法：SD雄性大鼠48只,SPF级,180-220g,试验性喂养3天后随机分6组(n=8),具体分组为丹参多酚酸盐(丹多酚)低剂量组(20mg/kg)、丹多酚高剂量组(60mg/kg)、双黄连低剂量组(750mg/kg)、双黄连高剂量组(2250mg/kg)、模型对照组、空白对照组。除了空白对照组,药物干预组与模型组的造模方法按照实验部分一中高剂量脂多糖注射(150ug/Kg,1周/1次,共6次)、70万IU/Kg维生素D3一次性腹腔注射联合高脂饮食进行复合造模,实验第6周开始,采用腹腔注射双黄以及丹多酚注射液进行干预,每日1次(共6周),空白对照组以及模型对照组则给予等量的生理盐水注进行腹注。第12周实验结束后采用腹主动脉采血休克法处死动物留取标本取材进行相关指标检测。ELISA法检测血清TNF-α、IL-6、P-selection水平；采用酶比色法检测血脂CHOL、TG、HDL-C、LDL-C水平；主动脉标本组织分别行HE染色进行病理形态学观察,分别采用免疫组化法以及Western Blot法检测主动脉组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达情况以及水平。结果：1.双黄连、丹参多酚酸盐注射液均能不同程度降低AS大鼠血脂水平,在CHOL、TG、LDL-C方面,高、低剂量的双黄连以及丹参多酚酸盐较模型组均有明显下降(P0.05),低剂量丹参多酚酸盐组在降低TG水平方面优于低剂量双黄连组(P0.05)；高剂量丹参多酚酸盐组降低LDL-C水平略优于双黄连组,但差异无统计学意义(P0.05)。2.双黄连、丹参多酚酸盐注射液均能不同程度降低AS大鼠血清TNF-a、IL-6、P-selectin水平,在TNF-α水平方面,低剂量双黄连、丹参多酚酸盐组较模型组下调不明显(P0.05),高剂量的双黄连以及丹参多酚酸盐组较模型组均有明显下降(P0.05)；在IL-6水平方面,低剂量双黄连组水平较模型组差异无统计学意义(P0.05),高剂量双黄连组与低、高剂量丹参多酚酸盐组较模型组明显下降(P0.05),高剂量组下调IL-6水平优于低剂量组,双黄连组差异有统计学意义(P0.05),而丹参多酚酸盐组差异无统计学意义(P0.05)；在Ps水平方面,低、高剂量双黄连组较模型组有下调,但差异无统计学意义(P0.05),而低高剂量丹参多酚酸盐组较模型组明显下调Ps水平(P0.05)。3.免疫组化与WB检测主动脉组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白,空白对照组主动脉未见斑块形成,主动脉组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达为阴性,模型组主动脉斑块TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达呈强阳性表达；采用不同剂量双黄连注射液、丹参多酚酸盐注射液进行干预后均能不同程度减少斑块内TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表达,低剂量双黄连与丹参多酚酸盐组较模型组均能有下降动脉粥样斑块组织TLR4、MyD88蛋白表达,但差异无统计学意义(P0.05),高剂量双黄连与丹参多酚酸盐组较模型组则显著降低TLR4、MyD88表达,且高剂量组优于低剂量组(P0.05)；NF-κB蛋白,高、低剂量的双黄连以及丹参多酚酸盐组较模型组下降NF-κB蛋白的表达(P0.05),且两个药物的高剂量组均优于低剂量组(P0.05)。4.主动脉组织HE染色光镜下观察,模型组血管内皮连续性受损害,内膜增厚明显并可见平滑肌细胞增殖和迁移,多处有粥样斑块形成,斑块内可见脂质斑块和泡沫细胞积聚,蓝色颗粒钙化灶,炎性细胞聚集,管腔可见斑块破裂,混合血栓,主动脉管腔明显狭窄：低剂量双黄连注射组较模型组主动脉斑块改善程度不够明显,高剂量的双黄连以及低、高剂量丹参多酚酸盐组较模型组从内膜增厚程度、泡沫细胞、炎症细胞浸润、脂质沉积以及斑块大小程度均有有所改善,提示双黄连注射液、丹参多酚酸盐注射液对复合因素导致的大鼠AS模型能够起到保护血管内皮,减少泡沫细胞以及脂质沉积,延缓并稳定动脉粥样斑块,高剂量丹参多酚酸盐略优于高剂量双黄连。结论：1.复合因素复制的AS大鼠模型中,TLR4、MyD88、NF-κ0蛋白表达升高,TNF-α、IL-6水平升高,提示高脂饮食以及脂多糖刺激通过激活TLR4信号,经过MyD88依赖途径激活NF-κβ蛋白促进下游炎症因子释放,从而促进动脉粥样硬化；2.双黄连、丹参多酚酸盐均能降低AS大鼠炎症因子TNF-α、IL-6水平,减轻炎症反应抑制AS进展,丹参多酚酸盐还可通过下调Ps进一步稳定及延缓动脉粥样硬化斑块的进展；3.双黄连、丹参多酚酸均能降低AS大鼠模型血脂水平,其中丹参多酚酸盐降低LDL-C、TG效果略优于双黄连注射液；4.双黄连、丹参多酚酸盐通过不同程度干预TLR4/MyD88/NF-κβ信号通路从而抑制动脉粥样硬化进程,稳定动脉粥样斑块；5.丹参多酚酸盐在抗大鼠AS进程以及促进斑块稳定上优于双黄连,这与丹参多酚酸盐在降低TG、LDL-C水平,抑制血小板活化Ps的方面略优于双黄连注射液有关。第三部分临床研究AM I热毒证候病因探讨的临床回顾研究目的：本研究以冠心病急性心肌梗死患者(AMI, Acute myocardium infarction)为研究对象,对我院近几年AMI患者的中医证候,冠心病危险因素、理化检查、血管病变情况、住院病情以及并发症等进行调查分析,并重点对可能揭示AMI热毒证候病因的要素进行单因素以及多因素Logistic筛选分析,为探讨冠心病热毒证病机、指导清热、活血法治疗冠心病提供临床证据。方法：单中心、回顾性调查方法,以符合纳入标准的的患者为研究对象,设计《冠心病急性心肌梗死患者证候与病情调查表》对研究对象的中医证候、冠心病危险因素、理化检查、住院病情等资料进行收集整理,重点对可能揭示AMI热毒证候病因的要素进行单因素以及多因素Logistic回归分析进筛选。结果：1.本研究中总共纳入322例研究对象。AMI中医证型以实证,虚实夹杂为主,证候分布频次以血瘀、热毒、痰浊、气滞等实证为主,单纯以某一病理因素为主的实证证型比例较少,实证之间多有兼夹,其中以热毒血瘀、痰瘀互结两者在实证中所占比例最高；在虚实夹杂证中,以血瘀、痰浊兼夹气虚证多见,热毒证组在本研究中的AMI患者中所占的比例为42.20%(136例),非热毒组所占的比例为57.8%(186例)。2.本研究中,男性是AMI的高发人群,比例高达82.9%,心肌梗死中吸烟人群占37.2%,合并高血压病史、糖尿病病史、高脂血症、心脑血管家族史比例分别为51.8%、36.6%、64.9%、12.4%,进行单因素分析发现,AMI热毒证患者多为吸烟、辛辣厚味饮食、糖尿病、高脂血症多重心血管危险因素聚集人群(P0.05),进行多因素logistic回归分析发现,吸烟、低密度脂蛋白、甘油三酯三个因子是预测AMI热毒证候病因的独立要素,OR值分别为1.755、1.637、1.483。3.本研究中AMI热毒证与非热毒证病情以及预后方面,在病变血管数上,热毒组的三支血管病变数目以及平均病变血管数目较非热毒组多(P0.05),在PCI术后并发症与合并症方面：泵功能水平、低血压状态、机械并发症、肺部感染的组间分布未见明显差异(P0.05),在住院期间死亡的终点事件上非热毒证组(4.3%)高于热毒证组(1.5%),但差异无统计学意义,在恶性心律失常的发生率,非热毒证组高于热毒证组(P0.05),这也是非热毒证组死亡率稍高于热毒证组的主要原因；无创心功能评估方面,在左心室射血分数、左心室舒张末容积指标上,热毒证组均差于非热毒证组(P0.01),提示冠心病急性心肌梗死热毒证患者远期预后可能较差,发生心脑血管不良事件可能性更大,具体结果需要完善随访调查研究以进一步得出严谨结论。结论：AMI中医证型以实证,虚实夹杂为主,证候分布频次以血瘀、热毒、痰浊等实证为主；AMI热毒证候患者为吸烟、辛辣厚味饮食、糖尿病、高脂血症多重心血管危险因素聚集人群,其中吸烟、低密度脂蛋白、甘油三酯三个因子是AMI热毒证候病因的独立要素,AMI热毒证组冠脉血管病变总体程度以及左心室射血分数、左心室舒张末容积方面严重于非热毒证组,提示AMI热毒证患者远期预后可能较差,发生心脑血管不良事件可能性更大,提示临床对一些长期吸烟、血脂水平异常升高的冠心病患者应加强戒烟宣教,合理改善膳食结构,降低血脂水平,同时在西药治疗的基础上应增加清热解毒活血中药方剂的使用,从而改善患者的临床症状以及远期预后。
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【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R285.5;R-332

【参考文献】