Wip1在间充质干细胞治疗小鼠1型糖尿病模型中的功能研究

发布时间：2018-04-01 11:19

  本文选题：1型糖尿病　切入点：间充质干细胞　出处：《天津医科大学》2016年博士论文

【摘要】：目的:利用小鼠1型糖尿病(type 1 diabetes,T1D)模型,探讨Wip1在间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)治疗T1D中的调控作用和Wip1缺失对MSCs免疫调节能力的影响,阐明MSCs治疗T1D的机制,为MSCs的临床应用提供理论与实验依据。方法:1.小鼠T1D模型的建立。分别对小鼠给予连续小剂量腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立缓慢模型(slow-type model)或单次大剂量腹腔注射链脲佐菌素建立快速模型(fast-type model)。比较两种模型小鼠的血糖变化、体重改变、生存状态及胰岛病理学改变,选择最佳建模方法。2.分离培养Wip1野生型(Wip1~(+/+))MSCs和Wip1缺失型(Wip1~(-/-))MSCs。取1周龄乳鼠鼠尾提取基因组DNA,行Wip1基因型鉴定,分别从Wip1~(+/+)和Wip1~(-/-)小鼠的骨实质组织提取并培养MSCs;倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞术检测MSCs细胞表型;诱导MSCs向成脂肪细胞和成骨细胞分化,通过油红O染色法检测MSCs的成脂分化能力,碱性磷酸酶染色法检测MSCs的成骨分化能力。3.Wip1在MSCs治疗小鼠T1D中的作用。建立小鼠T1D模型,并给予Wip1~(+/+)MSCs或Wip1~(-/-)MSCs治疗。通过监测随机血糖变化;HE染色和胰岛素免疫组化染色检测胰岛病理改变情况;流式细胞术和RT-PCR检测脾脏T细胞亚群与炎性因子的表达差异;HE染色、Masson染色、PASM染色和RT-PCR检测肾脏病变程度,比较Wip1~(+/+)MSCs与Wip1~(-/-)MSCs对小鼠T1D模型治疗效果的差异。4.Wip1调控MSCs免疫调节功能的作用机制。对T1D模型小鼠分别输注荧光标记的Wip1~(+/+)MSCs和Wip1~(-/-)MSCs,分别于第3天和第7天收取小鼠脾脏,病理组织切片法结合免疫荧光细胞计数检测MSCs的归巢能力,RT-PCR检测脾淋巴细胞内Notch1与Hes1的表达水平;并通过免疫组织化学法检测NICD的活化情况;同时在体外将DC分别与Wip1~(+/+)MSCs或Wip1~(-/-)MSCs共培养,检测MSCs对DC成熟及DC内Notch1及Hes1表达水平的影响。结果:1、两种模型建立的实验结果表明,缓慢模型与快速模型的小鼠胰岛组织均受到明显破坏,表现为胰岛β细胞减少,血糖上升。但是缓慢模型组小鼠的体重下降较缓慢,血糖呈现逐步上升趋势,建模后8周内总死亡率为10%;而快速模型组小鼠体重下降迅速,建模早期血糖急剧上升,建模后8周内总死亡率为35%。缓慢模型血糖变化符合不接受干预的临床患者血糖变化规律,同时可避免因高死亡率造成的实验结果偏差,因此,本研究选用小鼠T1D缓慢建模法。2、利用骨片分离法分离获得Wip1~(+/+)MSCs与Wip1~(-/-)MSCs,细胞形态呈长梭形,传至3代后Wip1~(-/-)MSCs的生长速度显著低于Wip1~(+/+)MSCs;流式细胞术检测两种MSCs细胞表型,结果显示,均高表达CD29、Sca-1及CD90;不表达CD11b、CD34、CD45、CD31及MHCII;其中Wip1~(-/-)MSCs向脂肪细胞诱导分化后,脂滴的大小、密度较Wip1~(+/+)MSCs更小更细;向成骨细胞诱导分化后,Wip1~(-/-)MSCs的碱性磷酸酶活性也低于Wip1~(+/+)MSCs。3、将Wip1~(+/+)MSCs与Wip1~(-/-)MSCs分别输注小鼠T1D模型,结果表明,Wip1~(-/-)MSCs较Wip1~(+/+)MSCs抑制血糖升高和保护胰岛β细胞的能力均减弱,且降低Th1/Th2比值、下调炎性因子IFN-γ、TNF-α的表达以及上调IL-4、IL-10、IL-17、Foxp3表达的能力亦显著低于Wip1~(+/+)MSCs。Wip1~(-/-)MSCs治疗组的肾脏器官中TGF-β1/SMAD通路激活水平明显高于Wip1~(+/+)MSCs治疗组,I型胶原纤维的表达水平高,Masson染色显示肾小球纤维化增多;同时PASM染色显示Wip1~(-/-)MSCs治疗组小鼠肾小球系膜基质含量多于Wip1~(+/+)MSCs治疗组。4、Wip1缺失对MSCs归巢能力影响的研究结果表明,输注Wip1~(+/+)MSCs与Wip1~(-/-)MSCs治疗T1D模型鼠,第3d或第7d归巢至脾脏的细胞数均无统计学差异;Wip1~(+/+)MSCs治疗组脾细胞Notch1活化片段NICD含量高于Wip1~(-/-)MSCs治疗组,且Wip1~(+/+)MSCs治疗组脾细胞中Notch1和Hes1的mRNA表达水平也显著高于Wip1~(-/-)MSCs治疗组;进一步,将DC与Wip1~(+/+)MSCs或Wip1~(-/-)MSCs体外共培养,发现Wip1~(-/-)MSCs促进DC内Notch信号通路活化的能力减弱。结论:Wip1缺失导致MSCs分化能力下降,Wip1~(-/-)MSCs保护胰岛功能,恢复T1D小鼠免疫平衡,缓解糖尿病肾脏病变的能力均弱于Wip1~(+/+)MSCs,这可能与Wip1缺失抑制了MSCs激活免疫细胞内Notch1/Hes1信号通路的能力,不能有效改善T1D的免疫状态有关。
[Abstract]:Objective: the use of type 1 diabetic mice (type 1 diabetes, T1D) model of Wip1 in mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cells, MSCs) of regulation and Wip1 deletion in T1D treatment on MSCs immune regulation ability, clarifying the mechanism of MSCs treatment of T1D, to provide theoretical and experimental basis for the clinical application of MSCs methods: 1.. To establish the mouse model of T1D. Respectively in mice given continuous low dose intraperitoneal injection of streptozotocin (streptozotocin, STZ) (slow-type model) a slow model or a single large dose intraperitoneal injection of streptozotocin (fast-type model). The model of rapid change in body weight changes in blood glucose, two a mouse model of pathological changes, survival state and islet pathology, select the best modeling method of.2. isolated from wild type Wip1 (Wip1~ (+ / +) and Wip1 (MSCs) deletion type Wip1~ (- / -)) MSCs. 1 week old suckling mouse tail genomic DNA extraction, Wip1 base For type identification, respectively from Wip1~ (+ / +) and Wip1~ (- / -) mice bone parenchyma of isolated and cultured MSCs; cell morphology was observed under inverted microscope, to detect the phenotype of MSCs cells by flow cytometry; inducing MSCs into adipocytes and osteoblast differentiation and adipogenic differentiation ability of MSCs was detected by oil red O staining, alkaline phosphatase staining and osteogenic differentiation ability of.3.Wip1 mice with T1D in MSCs MSCs was detected. A rat model of T1D, and Wip1~ (+ / +) MSCs or Wip1~ (- / -) MSCs treatment. By monitoring the random blood glucose changes; HE staining and immunohistochemical staining of insulin islet pathological changes; flow cytometry and RT-PCR to detect the expression of splenic T cell subsets and inflammatory factor differences; HE staining, Masson staining, PASM staining and RT-PCR detection of renal lesions, compared with Wip1~ (+ / +) MSCs and Wip1~ (- / -) effect of MSCs on mice with T1D model The mechanism of the difference of.4.Wip1 regulation of immune function of MSCs. The T1D mice were infused with fluorescent Wip1~ (+ / +) MSCs and Wip1~ (- / -) MSCs, a mouse spleen at third days and seventh days respectively, immunofluorescence cell count MSCs homing histological method, the expression level of RT-PCR detection Notch1 and Hes1 in splenic lymphocytes; and through the activation of NICD was detected by immunohistochemical method and in vitro; DC and Wip1~ (+ / +) MSCs or Wip1~ (- / -) co culture MSCs, MSCs and DC detection of DC mature Notch1 and Hes1 expression. Results: 1, two models the experimental results show that the slow and rapid model mouse islet tissue was obviously damaged, as islet beta cells decreased, but the slow rise in blood sugar. The weight of model mice decreased slowly, blood sugar showed a gradual upward trend Modeling potential, the total mortality after 8 weeks was 10%; and the weight fast model mice decreased rapidly, modeling early sharp rise in blood glucose, total mortality within 8 weeks after modeling for 35%. model with slow changes in blood glucose blood glucose changes of clinical patients not receiving the intervention, but also can avoid the experimental results due to high mortality bias, therefore in this study, using mice T1D slow modeling method.2, using bone slices isolated by Wip1~ (+ / +) MSCs and Wip1~ (- / -) MSCs cells were long fusiform, spread to the 3 generation of Wip1~ (- / -) the growth rate of MSCs was significantly lower than that of Wip1~ (+) MSCs; flow cytometry two the phenotype of MSCs cells, results showed that both high expression of CD29, Sca-1 and CD90; the expression of CD11b, CD34, CD45, CD31 and MHCII; Wip1~ (- / -) MSCs induced differentiation into adipocytes, lipid droplet size, the density is Wip1~ (+ +) MSCs smaller and more fine; osteogenic induction After the Wip1~ (- / -) MSCs alkaline phosphatase activity was lower than that of Wip1~ (+ / +) MSCs.3, Wip1~ (+ / +) MSCs and Wip1~ (- / -) MSCs mice were infused T1D model, the results show that the Wip1~ (- / -) MSCs Wip1~ (+ / +) MSCs to blood sugar control and protection of islet beta cells were weakened, and reduce the ratio of Th1/Th2, down-regulation of inflammatory factor IFN- gamma, alpha TNF- expression and upregulation of IL-4, IL-10, IL-17, Foxp3 expression was significantly lower than that of Wip1~ (+) MSCs.Wip1~ (- / -) MSCs treatment group of kidney TGF- beta 1/SMAD pathway activation levels were significantly higher in Wip1~ (+ / +) MSCs treatment group, the expression level of collagen I, Masson staining showed increased glomerular fibrosis; and PASM staining showed that the Wip1~ (- / -) MSCs treatment group mice glomerular mesangial matrix content of more than Wip1~ (+ / +) MSCs.4 treatment group, the effect of Wip1 deletion on MSCs homing ability. The results showed that infusion of Wip1~ (+) MSCs With Wip1~ (- / -) MSCs treatment of T1D model rats, there was no significant difference in cell number 3D or the 7d homing to the spleen; Wip1~ (+ / +) MSCs treatment group spleen cell activation of Notch1 fragment of NICD was higher than that of Wip1~ (- / -) MSCs treatment group and Wip1~ (+ / +) expression of MSCs Notch1 and Hes1 group treated spleen cells the level of mRNA was significantly higher than that in Wip1~ (- / -) MSCs treatment group; further, DC and Wip1~ (+ / +) MSCs or Wip1~ (- / -) MSCs co cultured in vitro, found that Wip1~ (- / -) MSCs promotes weakened DC Notch signaling pathway. Conclusion: Wip1 MSCs led to a lack of differentiation ability, Wip1~ (-) MSCs protect islet function, restore the immune balance of T1D mice, alleviate diabetic nephropathy were weaker than Wip1~ (+ / +) MSCs, which may be related to the deletion of Wip1 inhibited MSCs activation ability of immune cells in the Notch1/Hes1 signaling pathway, can effectively improve the immune state of the T1D.

【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1;R-332

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