副溶血弧菌T3SS2新效应蛋白的鉴定及其功能的初步研究

发布时间：2018-04-05 17:22

  本文选题：副溶血弧菌　切入点：毒力因子　出处：《浙江理工大学》2016年硕士论文

【摘要】：副溶血弧菌是一种全球性传播的病原菌,感染时能引发急性肠胃炎、伤口感染,甚至诱发败血症。研究显示该菌毒力因子包括溶血毒素、粘附素、Ⅲ型及Ⅵ型分泌系统等,其中Ⅲ型分泌系统及其分泌的效应蛋白与其致病性密切相关。由染色体1编码的Ⅲ型分泌系统T3SS1分泌的效应蛋白主要通过诱导细胞自噬、变圆和裂解这一系列过程来发挥细胞毒性作用;染色体2编码的Ⅲ型分泌系统T3SS2分泌的效应蛋白主要通过破坏细胞骨架和操控细胞信号传导等发挥肠毒性作用。目前针对Ⅲ型分泌系统T3SS2的研究引起国内外学者的广泛关注,由于T3SS2有80个相关基因编码在VP-PAI毒力岛上,其中仅少数几个蛋白得到研究,因此本实验从中选出几个新型的效应蛋白进行研究。首先利用生物信息学技术从T3SS2相关VP-PAI上筛选出VPA1324和VPA1360两种基因,通过构建两种基因的重组表达载体,诱导表达并纯化蛋白,然后免疫小鼠获得相应抗血清。通过Western blot和RT-PCR两种方法验证在胆盐作用下VPA1324和VPA1360基因转录表达情况,结果显示VPA1324和VPA1360蛋白是T3SS2相关的分泌蛋白。其中VPA1324经生物信息学分析可能为二鸟苷酸磷酸二酯酶。为此,以c-di-GMP为底物,利用高效液相色谱法检测VPA1324蛋白酶活性,结果表明VPA1324可降解c-di-GMP,具有磷酸二酯酶活性。构建该基因的重组质粒pEGFP-VPA1324-C1并转染至Hela和Caco-2细胞中,发现VPA1324的表达导致细胞出现皱缩,通过Annexin V-FITC/PI双染色和Hoechst 33342染色分析,表明VPA1324可导致细胞发生凋亡。综上所述,VPA1324和VPA1360蛋白是T3SS2分泌的效应蛋白,VPA1324为一种磷酸二酯酶,能促使细胞凋亡。新效应蛋白的研究不仅有助于我们深入理解病原菌的毒力及感染作用机制,同时为真核生物本身的作用机制提供了独特的视角。
[Abstract]:Vibrio parahaemolyticus is a globally transmitted pathogen that can cause acute gastroenteritis, wound infection and even septicemia.The virulence factors include hemolytic toxin, adhesin, type 鈪，

本文编号：1715761