白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白在DENV2感染人角质形成细胞中的生物学功能初探

发布时间：2018-04-19 06:02

  本文选题：白纹伊蚊 + 34K2蛋白　； 参考：《贵州医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:获取纯化的白纹伊蚊(广州株)唾液34K2重组蛋白,体外探讨其在DENV2感染人角质形成细胞(Haca T)中可能的生物学功能。方法:IPTG诱导p ET-28-34K2/BL21(DE3)重组菌,12%SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的表达形式和分子量大小,镍柱亲和层析法纯化34K2重组蛋白(r Ab-34K2),免疫印迹(Western blotting)法对重组蛋白的特异性进行鉴定;实时无标记细胞动态分析法(RTCA)监测r Ab-34K2蛋白(1μg/m L、5μg/m L、10μg/m L)对Haca T细胞生长的影响及对DENV2(MOI=1)感染Haca T细胞引发细胞病变(CPE)效应的影响;q RT-PCR实时检测r Ab-34K2蛋白(1μg/m L、10μg/m L)对DENV2(MOI=1/0.1)感染Haca T细胞后病毒核酸、IFN-α/β、IL-1β、TNF-α、及IL-10的m RNA的变化;流式细胞术(FACS)检测r Ab-34K2蛋白(1μg/m L、10μg/m L)在DENV2(MOI=1)感染前后Haca T细胞凋亡的影响。结果:r Ab-34K2重组蛋白以包涵体形式表达,经尿素变复性后,亲和层析法可获得纯化的r Ab-34K2蛋白,蛋白浓度为350μg/m L;RTCA结果显示r Ab-34K2蛋白(1μg/m L、5μg/m L、10μg/m L)对人角质形成细胞(Haca T)的生长无明显影响;在DENV2(MOI=1)时,含10μg/m L r Ab-34K2蛋白组细胞指数(CI)峰值较病毒对照组降低1.3798倍(P0.05),CIT50(到达50%CI值时间)较对照组缩短5.9小时(P0.05);胞内DENV2 NS1核酸片段检测显示:MOI=1时,感染12h各组胞内病毒核酸表达较高,随后逐渐降低,感染36h时r Ab-34K2蛋白(1μg/m L、10μg/m L)组显著高于单纯DENV2感染组(其中1μg/m L组高于对照组2.6509倍,P0.05;10μg/m L组高于对照组3.5527倍,P0.01);在MOI=0.1时,感染48h、60h、70h后r Ab-34K2蛋白组胞内病毒核酸水平均较病毒对照组显著增高(其中48h时1μg/m L组高于对照组2.3333倍,P0.001,10μg/m L组高于对照组3.625倍,P0.001;60h时1μg/m L组高于对照组2.7778倍,P0.001,10μg/m L组高于对照组4倍,P0.001;70h时1μg/m L组高于对照组2.8846倍,P0.001,10μg/m L组高于对照组4.1538倍,P0.001);检测MOI=1感染模型中细胞因子的情况为:感染24h r Ab-34K2蛋白组IFN-α/β细胞因子的相对表达量显著低于病毒对照组(其中IFN-α:1μg/m L组低于病毒对照组1.7512倍,P0.05;10μg/m L组低于病毒对照组2.2531倍,P0.05;IFN-β:1μg/m L组低于病毒对照组3.7380倍,P0.01;10μg/m L组低于病毒对照组4.7230倍,P0.01);IL-1β相对表达量均显著上调,1μg/m L组高于病毒对照组5.6929倍,P0.001;10μg/m L组高于病毒对照组3.9384倍,P0.001;TNF-α的相对表达量有下调趋势,仅1μg/m L r Ab-34K2蛋白组与病毒对照组具有统计学差异(低于病毒对照组1.8294倍,P0.05);IL-10的相对表达量有上调趋势,与病毒对照组无统计学差异;细胞凋亡检测结果显示r Ab-34K2(1μg/m L、10μg/m L)处理后各组间凋亡率变化无统计学差异,但感染DENV2(MOI=1)24h后r Ab-34K2蛋白组较DENV2对照组细胞凋亡率显著增多(1μg/m L组凋亡率为(9.1767±2.6303)%,较对照组高2.1989倍,P0.05;10μg/m L组凋亡率为(10.6633±2.8243)%,较对照组高2.5551倍,P0.05)。结论:成功纯化获得白纹伊蚊唾液34K2原核重组蛋白,该重组蛋白可促进DENV2在Haca T细胞中增殖、CPE和引发细胞凋亡;r Ab-34K2蛋白可促进感染细胞表达IL-1β并调控IFN-α/β的产生。该实验结果为深入探讨白纹伊蚊唾液34K2蛋白在DENV2感染中的生物学功能提供了一定的实验证据。
[Abstract]:Objective: to obtain purified Aedes albopictus (Guangzhou strain) salivary 34K2 recombinant protein in vitro to investigate the formation of cells in DENV2 infected human keratinocytes (Haca T) in the possible biological function. Methods: IPTG P ET-28-34K2/BL21 (DE3) induced by recombinant bacteria, analysis of recombinant protein expression and molecular weight of 12%SDS-PAGE electrophoresis, purification the recombinant protein 34K2 affinity chromatography column (R Ab-34K2) Ni (Western blotting), Western blotting identified the specificity of recombinant protein; cell marker dynamic analysis method (RTCA) real-time monitoring of R Ab-34K2 protein (1 g/m L, 5 g/m L, 10 g/m L) effect on growth of Haca T cells and the DENV2 (MOI=1) Haca infection T cells trigger cytopathic effect (CPE); Ab-34K2 Q RT-PCR real-time detection of R protein (1 g/m L, 10 g/m L) to DENV2 (MOI=1/0.1) Haca infected T cells after viral nucleic acid, IFN- alpha / beta beta alpha, IL-1, TNF-, m the RNA and IL-10. 鍙樺寲;娴佸紡缁嗚優鏈，

本文编号：1771871