MicroRNA-132减轻脑出血模型小鼠的神经行为学及神经病理学改变

发布时间：2018-04-21 03:08

本文选题：脑卒中 + 脑出血　；参考：《天津医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:1,获得MicroRNA-132不同表达水平的小鼠。2,建立脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)模型。3,观察不同组别小鼠脑出血后神经功能行为学改变以及存活率。4,探究MicroRNA-132对脑出血后小鼠脑组织水肿、血肿体积及血脑屏障通透性的影响。5,评价不同组别小鼠脑组织中乙酰胆碱酯酶(AChE)含量。6,观察脑出血后小鼠脑组织中小胶质细胞浸润及神经元凋亡。7,探究脑出血后MiR-132对小鼠脑组织中IL-6,IL-1β以及TNF-α等炎性细胞因子mRNA转录水平的变化的影响。8,通过探讨不同MiR-132表达水平的小鼠脑出血后神经功能学、神经病理学改变以及中枢神经系统免疫炎症反应的变化,进一步探究MiR-132在小鼠脑出血模型中的作用及机制。方法:C57BL/6J雄性小鼠随机分为病毒对照组(LV-control)、MiR-132高表达组(LV-miR-132)、MiR-132低表达组(LV-anti-miR-132)并分别注射相应慢病毒,每组64只小鼠。2周后,三组小鼠接受自体血基底节注射获得脑出血模型。1,应用基底节原位注射方法分别对各组小鼠进行慢病毒注射,2周后应用免疫荧光染色及实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)验证各组别MiR-132的表达水平不同。2,采用内眦取血及基底节注射方法获得小鼠脑出血模型。3,分别用改良的神经功能评分、转角实验及前肢放置实验评价小鼠脑出血后1天及3天神经行为学改变及存活率。4,于小鼠脑出血后3天获得小鼠脑组织并称量其湿重,烘干后称量其干重从而获得脑组织含水量,通过甲醛固定及脑组织切片比较出血后3天脑组织血肿体积变化,5,股静脉注射伊文思蓝并计算不同组别脑组织中伊文思蓝的含量并通过蛋白印记方法评价紧密连接蛋白表达水平从而比较各组小鼠血脑屏障破坏情况。6,通过组织免疫荧光染色比较各组小鼠脑组织中小胶质细胞的浸润及神经元凋亡。7,采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)方法检测不同组别脑出血小鼠中枢脑组织中IL-6,IL-1β以及TNF-α等炎性细胞因子mRNA转录水平。8,通过蛋白印迹评价不同组别小鼠中枢脑组织中乙酰胆碱酯酶的表达水平。从而探索miR-132在脑出血模型中发挥的作用及可能的机制。结果:1,给三组小鼠分别注射不同慢病毒2周后,通过免疫荧光染色及实时荧光定量PCR检测证实不同组别小鼠miR-132表达水平不同。2,采用小鼠内眦静脉取血并将其注射至右侧基底节成功建立脑出血模型。3,神经功能学评分结果显示LV-miR-132组小鼠脑出血后1天及3天神经功能缺损均较LV-control组明显减轻(P0.05),而LV-anti-miR-132组神经功能缺损要重于对照组(P0.05),miR-132表达水平影响小鼠脑出血后存活率,LV-miR-132组较LV-control组存活率提高,LV-anti-miR-132组较LV-control组存活率降低,但三组之间的差异无统计学意义。4,通过计算小鼠出血后3天脑组织含水量来评价脑水肿,结果显示脑出血侧脑组织含水量LV-miR-132组较LV-control组明显减少(P0.01),但对侧脑组织及小脑的含水量两组之间并无统计学差异,miR-132的低表达组较对照组脑水肿变化并不显著。对3天后脑血肿变化情况的统计分析显示miR-132的过表达可减小血肿体积但无统计学差异。5,对各组小鼠股静脉注射伊文思蓝(EB))后比较其在各组小鼠脑组织中外渗的情况并计算其在脑组织中的含量,结果显示LV-miR-132组较LV-control组EB的含量明显减少(P0.05),LV-anti-miR-132组较LV-control组EB含量显著增多(P0.05)。免疫印迹法分析紧密连接蛋白claudin-5 and ZO-1的表达水平各组之间也有统计学差异(P0.01),以上结果证实miR-132的高表达会减轻血脑屏障的破坏。6,免疫荧光染色结果显示各组小鼠脑组织中活化的小胶质细胞数目不同,LV-miR-132组与LV-control组相比小胶质细胞明显减少(P0.01),而miR-132低表达组小胶质细胞数量增加(P0.05),免疫印迹法进一步印证了这一结论,同时,通过免疫荧光法对凋亡细胞进行统计分析得出结论miR-132的过表达可减少小鼠出血后脑组织中的细胞凋亡(P0.01),而miR-132的低表达则会加剧细胞的凋亡(P0.01)。7,RT-q PCR显示miR-132的表达水平会影响小鼠脑出血后3天脑组织中IL-6,IL-1β以及TNF-α等炎性细胞因子mRNA转录水平,其中LV-miR-132组较LV-control组三种炎性细胞因子的转录均明显减少(P0.01),LV-anti-miR-132组较LV-control组炎性细胞因子转录增多(P0.01)。8,免疫印迹法分析小鼠脑组织中乙酰胆碱酯酶(AChE)含量,结果发现脑出血后3天各组间AChE表达水平不同,miR-132过表达组其含量明显减少(P0.01),相反miR-132低表达组较对照组其含量明显增加(P0.01),进一步分析认为miR-132通过影响AChE的表达从而发挥其作用。结论:1,成功获得三组miR-132表达水平不同的小鼠,其中LV-miR-132组表达水平上调,LV-anti-miR-132组miR-132的表达较对照组明显减少。2,小鼠脑出血后表现为神经功能缺损,miR-132过表达可明显改善小鼠脑出血后1天及3天神经功能缺损症状,而抑制miR-132的表达则会加重其功能缺损症状。同时对小鼠脑出血后存活率分析发现miR-132亦可提高存活率但差异无统计学意义。3,脑出血后表现为脑组织水肿,miR-132过表达可减少出血侧脑组织含水量即水肿程度,但并不影响对侧脑组织及小脑含水量,miR-132的低表达则会加重脑水肿,而对各组小鼠脑组织血肿体积的分析发现,miR-132并不改变血肿程度。4,脑出血后最直接及最突出的表现为血脑屏障的改变进一步导致脑水肿等的发生,观察伊文思蓝在脑组织出血侧渗出情况及紧密连接蛋白含量测定可以评价脑组织血脑屏障破坏程度,实验发现小鼠脑出血后3天,miR-132的过表达可减少伊文思蓝渗出,其在脑组织中的含量明显减少,同时紧密连接蛋白的含量明显增多,以上均说明miR-132可减轻血脑屏障的破坏程度。5,活化的小胶质细胞参与中枢神经系统脑组织的炎症过程,炎症反应可进一步加重脑出血后细胞的凋亡,通过免疫荧光染色发现miR-132的过表达可明显减少活化的小胶质细胞,同时也减少细胞的凋亡。而抑制miR-132的表达则会加剧这一过程。6,MiR-132有可能通过减少脑中相关促炎因子的基因表达来发挥其在出血的脑组织中的作用,RT-q PCR证实相关因子在高表达miR-132组的小鼠脑组织中明显减少,进一步印证了其抗炎作用。7,乙酰胆碱酯酶(AChE)是miR-132的作用靶点,而乙酰胆碱的抗炎作用已经被证实,免疫印迹法证实miR-132的过表达组小鼠出血脑组织中AChE的含量减少,进一步说明miR-132是通过乙酰胆碱的抗炎通路发挥其作用。
[Abstract]:Objective : To investigate the effects of MiR - 132 on brain edema , hematoma volume and immune inflammatory response in mice after intracerebral hemorrhage . The results showed that the expression of miR - 132 decreased significantly compared with LV - control group ( P0.05 ) . The results showed that the low expression level of miR - 132 decreased significantly ( P0.05 ) , but the expression level of LV - anti - miR - 132 was significantly decreased compared with LV - control group ( P0.05 ) . It was found that miR - 132 can reduce the degree of damage of brain barrier by reducing the expression of miR - 132 in brain tissue .

【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743.34;R-332

【参考文献】