Lkb1基因在小鼠内耳和小脑发育中的功能研究

发布时间：2018-05-03 12:17

  本文选题：LKB1 + 毛细胞　； 参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景LKB1基因编码一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,又被称为STK11,它被认为是一种肿瘤抑制因子,在个体生长发育和肿瘤发生过程中起至关重要的作用。Peutz-Jephers综合征(PJS)是一种常染色体显性遗传病,被称为皮肤黏膜色素沉着和胃肠道息肉综合征,简称黑斑息肉综合征。它的主要临床表现为皮肤粘膜色素沉着和多发性错构瘤样胃肠道息肉,并具有高度易感性。近年来,LKB1基因被公认为是PJS的主要致病基因。然而,由于LKB1基因致病机制错综复杂,至今未能完全阐明。为了进一步确定LKB1是否是PJS综合征的关键致病基因,并检测LKB1基因的生物学功能,2002年,Jishage et al等人制作了一个Lkbl基因敲除小鼠。在LKB1纯合敲除小鼠中,他们发现LKB1纯合敲除小鼠死于妊娠中期,约胚胎期8.5至9.5(E8.5-9.5)天,表现出胚胎神经管缺陷,间充质细胞死亡和血管异常等。在交配后9.5天时,与同窝小鼠胚胎相比,纯合敲除小鼠胚胎体型较小,并且发育迟缓。另外,在10-14个月的杂合突变小鼠中,发现多处胃肠息肉。这些结果都暗示了Lkbl基因在小鼠胚胎发生以及发育过程中是必不可少的,与肿瘤的发生息息相关。目前,作为一个肿瘤抑制因子,LKB1已经成为研究热点,深受研究者们的青睐。LKBl基因表达广泛,几乎在所有组织中均有表达,其中在上皮、胃、肠和睾丸生精小管等组织器官中表达水平较高。由于LKB1基因的广泛表达和重要的生物学功能,因此LKB1全身性敲除小鼠在胚胎期致死,从而大大阻碍了在体内对LKB1生物学功能的研究。近年来,为了能更好的研究LKB1基因在体内的生物学功能,已经有不少条件敲除小鼠模型被相继制作。现已报道LKB1基因在体内能够介导TGF-β、NF-κB、PTEN/PI3K、G蛋白偶联、mTOR等多条信号通路,在细胞生长调控中发挥重要作用。LKBl参与调控多种细胞活动,包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞极性建立、染色质重构以及能量代谢等。但是,Lkbl基因在小鼠神经系统中的研究还不够深入,在内耳和小脑发育中的功能均未见报道。因此,在本论文中,我们利用LKB1条件敲除小鼠研究了Lkbl基因在小鼠内耳和小脑发育中的功能及其的分子机制。拟解决的科学问题本论文利用条件性基因敲除技术,获得两种Lkbl基因特异性敲除小鼠,即Pax2-LKB1条件敲除小鼠和Atohl-LKB1条件敲除小鼠。利用这两种敲除小鼠模型,我们研究了Lkbl基因在小鼠内耳和小脑发育过程中重要的生物学功能及其分子机制。拟解决的科学问题为：(1)LKB1在小鼠内耳毛细胞发育中的作用；(2)LKB1调节内耳毛细胞发育的分子机制；(3)LKB1在小鼠小脑发育及脑叶形成中的功能；(4)LKBl调节小脑发育及脑叶形成中的分子机制。研究方案及取得的成果本论文为了解决以上科学问题,我们以小鼠为实验材料,利用Cre-LoxP系统,首先制作了Pax2-Cre介导的LKB1特异性敲除的小鼠模型,即Pax2-LKB1条件敲除小鼠。在本论文中,我们首先利用Pax2-LKB1条件敲除小鼠,研究了Lkbl基因在内耳毛细胞发育中重要的生物学功能。Pax2-Cre表达时间较早,大约在胚胎期7-8天时表达并将Lkbl基因在内耳中特异性剔除。在研究中,我们发现,一小部分Pax2-LKB1条件敲除小鼠在胚胎期死亡,另一部分小鼠在出生前E18.5天时仍然存活,但出生时致死,小鼠个体之间存在一定差异。所有的Pax2-LKB1条件敲除小鼠胚胎均苍白无血色。为了研究Lkbl基因在小鼠内耳毛细胞发育中的功能,我们使用鬼笔环肽(phalloidin)免疫荧光染色技术检测了在胚胎期17.5-18.5天的耳蜗毛细胞静纤毛束的形态。结果显示,在野生型小鼠中,耳蜗毛细胞静纤毛束呈整齐的V字形,且V字形开口一致。然而,在Pax2-LKB1条件敲除小鼠中,耳蜗毛细胞静纤毛束呈聚集状态,且静纤毛束朝向紊乱。我们用动纤毛的标记物Tubulin对小鼠内耳毛细胞动纤毛进行了免疫荧光染色。结果显示,在野生型小鼠中,动纤毛位置统一,均位于毛细胞顶表面侧边的中间,且位于静纤毛束V字形的顶点。但是,在Pax2-LKB1条件敲除小鼠中,动纤毛定位异常,定位于毛细胞顶表面侧边的随意位置。接下来,我们利用扫描电镜技术更清楚的观察了内耳毛细胞听纤毛的形态结构。结果同样显示在Pax2-LKB1条件敲除小鼠中,静纤毛形态紊乱,V字形朝向随意。大部分动纤毛仍然定位于静纤毛束V字形的顶点,但动纤毛没有规则的定位到毛细胞顶表面侧边的中心。在个别毛细胞中动纤毛没有定位在V字形的顶点处,动纤毛的定位出现了一定偏差。在毛细胞听纤毛的发育过程中,动纤毛的迁移常常决定了静纤毛束的定位和朝向。静纤毛V字形的朝向是毛细胞平面极性(PCP)的重要标志。因此,我们提出在早期胚胎发育过程中,LKB1对小鼠耳蜗毛细胞平面极性的建立起重要作用。由于Pax2-Cre介导的Pax2-LKB1条件敲除小鼠胚胎期致死,使我们不能对Lkbl基因在内耳中的功能进行深入研究。因此,我们选择另一种Atoh1-Cre转基因小鼠,制作了Atoh1-LKB1内耳特异性敲除小鼠。由于Atohl-Cre较Pax2-Cre的表达时间晚,大约在胚胎期13.5-14.5天时表达,Atoh1-LKB1条件敲除小鼠可存活至成体,且发育良好。利用Atoh1-LKB1特异性敲除小鼠,我们进一步研究了LKB1在小鼠内耳毛细胞发育和成熟过程中的重要功能及其可能的致病机制。与同窝成体野生型小鼠相比,Atoh1-LKB1条件敲除小鼠的体型较小,且体重较轻,但是在整体形态上没有表现出明显的异常。在听力的检测中发现,Atoh1-LKB1敲除小鼠的听力损失严重。为了进一步检测Lkbl基因在小鼠内耳毛细胞发育中的功能,我们运用Phalloidin的免疫荧光染色技术检测了小鼠内耳毛细胞静纤毛的形态结构。结果显示在Atoh1-LKB1条件敲除小鼠中,在P1天时,内毛细胞和外毛细胞的听纤毛有轻微的异常,但不明显。然而,在P7天时,外毛细胞的静纤毛呈现U字形且阶梯状形态紊乱。在P7天之后,Atoh1-LKB1敲除小鼠的耳蜗外毛细胞静纤毛的紊乱程度加重。另外,我们还发现在P14天时外毛细胞开始出现零星丢失的现象。鉴于耳蜗毛细胞表型出现的时间差,我们认为Lkbl基因的缺失可能直接引起毛细胞静纤毛的形态和功能的异常,最终导致内耳毛细胞的缺失。内耳毛细胞静纤毛的核心结构是由紧密组装的单极性肌动蛋白丝和若干肌动蛋白连接蛋白组成,如ERM(ezrin/radixin/moesin)蛋白家族、villin、fimbrin、 XIRP2和]FASCIN2等。这些肌动蛋白连接蛋白参与肌动蛋白为基础的骨架结构的组装,可以维持静纤毛的稳定性,对毛细胞静纤毛束的形态发生起重要作用。在本研究中,我们检测了肌动蛋白连接蛋白ERM。使用免疫荧光的方法检测到ERM蛋白主要表达在小鼠耳蜗毛细胞的静纤毛上。Western blot结果显示在Atoh1-LKB1条件敲除小鼠中,与ERM的蛋白表达水平相比,p-ERM有明显的下降。我们推测,在Atoh1-LKB1条件敲除小鼠中,p-ERM表达水平的明显下降很可能是毛细胞静纤毛中肌动蛋白组装失败的一个重要原因。据报道在小肠上皮细胞中,LKB1可以通过控制Mst4间接地磷酸化激活ERM家族成员中的Ezrin。活化的p-Ezrin进而能调节小肠上皮细胞刷状缘结构的形成。由于小肠上皮刷状缘结构与内耳听纤毛结构类似,都是有肌动蛋白丝组装而成的。因此,我们进一步检测了在小鼠内耳中Mst4的表达。结果显示,Mst4在小鼠内耳毛细胞中表达水平较高。Western blot结果显示在Atohl-LKB1条件敲除小鼠中,LKB1敲除后使Mst4的蛋白表达水平明显下降。因此,我们推测Mst4可能作为LKB1和ERM的中间调节蛋白调节内耳毛细胞听纤毛的发育和维持。综上所述,在小鼠内耳毛细胞发育过程中,LKB1可以通过激活ERM家族蛋白调节耳蜗毛细胞静纤毛的发育和维持,进而保证正常的听觉功能。由于Atohl-Cre不仅在内耳中表达,而且在小脑中也有表达。因此,我们选择Atohl-LKB1条件敲除小鼠继续研究了Lkbl基因在小鼠小脑中的功能。在本论文中,我们研究了在小鼠小脑发育中,LKB1在小脑发育和脑叶形成中的重要功能及其分子机制。小脑是中枢神经系统中重要的组成部分,参与更高水平的功能,包括认知,情感,语言处理以及运动协调等能力。在本论文中,我们首先采用了一系列行为学实验,包括步态检测、滚筒试验和悬挂实验,检测了Atohl-LKB1条件敲除小鼠的运动协调能力。结果显示,Atoh1-LKB1条件敲除小鼠的运动协调能力明显下降。与成体野生型小鼠相比,Atohl-LKB1条件敲除小鼠的小脑容积增大,脑小叶增多,小脑复杂程度明显增加。据研究报道,小脑脑叶的形成与颗粒细胞祖细胞的增殖紧密相关。随后,我们利用增殖细胞的标记物PH3和BrdU的免疫荧光染色的方法检测发现Atohl-LKB1条件敲除小鼠小脑颗粒细胞祖细胞(GCPs)过度增殖。BrdU追踪实验检测发现在Atoh1-LKB1条件敲除小鼠中,LKB1的敲除影响了颗粒细胞正常迁移至内颗粒细胞层。因此,在小鼠小脑发育过程中,Lkbl基因的缺失不仅引起了颗粒细胞祖细胞增殖的加快,而且也影响了颗粒细胞的正常迁移。另外,我们也发现在Atohl-LKB1条件敲除小鼠小脑中,浦肯野细胞发育不良,部分区域呈聚集状态。这些异常的表型暗示了LKB1在小脑发育中起着重要的作用。根据之前的研究报道,Shh信号对颗粒细胞祖细胞的快速增殖有重要作用。Shh信号是通过由其下游的转录调节因子Gli家族来调节的。在本研究中,我们检测了Gli1、Gli2和Gli3的表达,Western blot结果显示在Atoh1-LKB1条件敲除小鼠中,G1i家族基因的表达水平明显上升,这表明了Shh信号的增强。Cyclin D1是Shh信号下游的靶蛋白,在颗粒细胞祖细胞增殖过程中,Cyclin D1能够调节细胞周期的顺利进行。在本研究中,我们也发现在Atoh1-LKB1条件敲除小鼠中Cyclin D1的表达水平升高。因此,这些结果揭示了在Atoh1-LKB1条件敲除小鼠中,LKB1缺失引起了Shh信号和CyclinD1的表达上调,最终导致了颗粒细胞祖细胞的过度增殖。为了进一步确定Lkbl基因是否通过Shh信号调节颗粒细胞祖细胞的增殖,我们利用Shh信号抑制剂在体外检测了颗粒细胞祖细胞的增殖情况。体外实验结果与体内的结果一致,结果显示了LKB1可能通过控制Shh信号水平调节颗粒细胞祖细胞的增殖。据报道AMPK能够作为LKB1的直接的下游靶蛋白激活多种信号通路；在体外AMPK可以与Glil相互作用负调控Shh信号。在我们的研究中,Western blot结果显示,在Atoh1-LKB1条件敲除小鼠中总的AMPK表达水平没有明显差异,但是磷酸化的AMPK的水平明显下降。因此,AMPK很有可能作为LKB1和Shh信号的中间调节蛋白调节小脑的正常发育。综上所述,在小脑发育过程中,LKB1可以通过控制Shh信号介导的颗粒细胞祖细胞的增殖和颗粒细胞的迁移来调节小脑发育和脑叶形成。研究意义本论文利用LKBl特异性敲除小鼠模型,阐明了Lkbl基因在小鼠内耳和小脑发育过程中起重要功能,从细胞水平和分子水平上揭示了LKB1调节耳和小脑发育的机制,为进一步研究哺乳动物神经系统的发育提供了理论依据。此外,神经系统相关疾病是一类常见疾病并且在医学界很难治愈。在人类神经系统中存在很多与内耳和小脑相关的疾病包括耳聋,运动能力失调,小脑蚓体发育不良等,然而这些疾病的诊断和发病机制尚未研究清楚。本研究制作的Atohl-LKB1条件敲除小鼠可以作为人类疾病的理想模型为哺乳动物听力损失和小脑中相关疾病的临床诊断和治疗提供新的思路,具有一定的指导意义。我们也可以从这些病人中,特别是PJS综合征病人中筛选是否存在LKBl基因突变,这可能为以后药物靶点设计和神经相关疾病的治疗提供理论基础。因此,我们的研究成果不仅为内耳和小脑发育的基础研究填补了空白,并且在一定程度上推动了内耳和小脑疾病临床诊断治疗的发展。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R3416
，

本文编号：1838451