重组人B细胞激活因子融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定
本文选题:B细胞激活因子 + 受体 ; 参考:《军事医学》2013年02期
【摘要】:目的获得人类B细胞激活因子(B cell activating factor,BAFF)胞外段融合蛋白并对其生物活性进行分析。方法构建pET32a/BAFF的原核表达载体,进行原核表达、亲和纯化,并通过SDS-PAGE、Western印迹进行鉴定。利用非还原电泳后的Western印迹与HPLC分析融合蛋白在溶液中的存在形式。ELISA、Octet RED系统检测rhBAFF结合受体TACI的能力并做出实时动力学分析。MTS法检测rhBAFF促进B细胞增殖的活性。结果融合蛋白在大肠杆菌BL21中以可溶形式高效表达,经Ni-NTA纯化获得的目的蛋白纯度超过90%;SDS-PAGE、Western印迹显示在相对分子质量为36×103位置有目的蛋白的特异条带;非还原电泳及HPLC分析表明,重组蛋白以三聚体的形式存在;ELISA、Octet RED系统同时证实BAFF可与受体TACI结合;增殖实验证实重组蛋白具有生物学活性。结论成功获得纯度超过90%的rhBAFF可溶蛋白,实验证实为具有生物学活性的三聚体结构。
[Abstract]:Objective to obtain the extracellular fusion protein of human B cell activator B cell activating factorial (BAFF) and analyze its biological activity. Methods the prokaryotic expression vector of pET32a/BAFF was constructed for prokaryotic expression, affinity purification, and identified by SDS-PAGEG Western blot. Western blot and HPLC after non-reductive electrophoresis were used to analyze the existing form of the fusion protein in solution. ELISAN Octet RED system was used to detect the ability of rhBAFF binding receptor TACI and real-time kinetic analysis was made to detect the activity of rhBAFF to promote the proliferation of B cells. Results the fusion protein was highly expressed in the soluble form of Escherichia coli BL21. The purity of the target protein purified by Ni-NTA was more than 90%. The specific band of the target protein was found at the position of relative molecular weight of 36 脳 10 ~ 3.The results of non-reductive electrophoresis and HPLC analysis showed that the fusion protein was highly expressed in E. coli. The recombinant protein existed in the form of trimer and the RED system confirmed that BAFF could bind to the receptor TACI, and the proliferation test confirmed that the recombinant protein had biological activity. Conclusion the rhBAFF soluble protein with purity of more than 90% was successfully obtained and proved to be biologically active trimer structure.
【作者单位】: 军事医学科学院基础医学研究所免疫学研究室;解放军第305医院检验科;
【基金】:国家重大新药创制科技重大专项资助项目(20102X09401-407) 国家863计划重大项目(2012AA02A302)
【分类号】:R392.1
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