应用噬菌体展示肽技术筛选尘螨变应原B细胞表位模拟肽及其体内外生物学功能的研究

发布时间：2018-05-14 11:47

本文选题：噬菌体肽库 + B细胞表位　；参考：《华中科技大学》2015年博士论文

【摘要】：尘螨是引起变应性疾病的主要变应原,用尘螨变应原提取物进行临床检测和特异性免疫治疗应用广泛。然而尘螨提取物受原材料和提取技术等因素的影响,在蛋白成分、含量及纯度等方面差异性大,直接影响了临床诊断的准确性以及特异性免疫治疗的疗效和安全性。本研究中,我们抛开对变应原本身的研究,用尘螨变应原阳性患者血清中针对尘螨的特异性IgE抗体为钓饵,进行由果到因的反推。通过噬菌体展示随机肽技术进行阴阳双重筛选,得出与尘螨特异性IgE结合的模拟肽。首先用尘螨变应原IgE阴性的过敏患者血清中IgE进行阴性筛选排除IgE保守的重链结合肽,再用尘螨阳性患者血清中IgE为钓饵,得到和IgE抗体高变区结合的尘螨B细胞线性以及构象表位模拟肽库。为了验证筛选的尘螨B细胞表位模拟肽的体内生物学功能,我们利用户尘螨诱发的变应性鼻炎伴支气管哮喘小鼠模型,观察所筛选的尘螨B细胞表位模拟肽1,2与3对小鼠模型气道炎症的治疗作用,为进一步研制和开发尘螨特异性免疫治疗的B细胞表位疫苗提供实验依据。一、与尘螨IgE结合的噬菌体的筛选1、噬菌体的亲和筛选：以尘螨IgE阴性的过敏患者血清IgE为诱饵进行阴性筛选,获得不能结合的噬菌体,然后再以尘螨阳性患者血清IgE抗体为诱饵进行阳性筛选,选出能够结合的噬菌体。在筛选过程中,通过降低钓饵的浓度、减少钓饵与肽库作用时间、增加洗脱强度,去除不能与尘螨IgE结合和与尘螨IgE结合较弱的噬菌体,经三轮筛选后得到富集程度较高的分别与尘螨IgE特异性结合的噬菌体克隆。2、挑选与IgE特异性结合的噬菌体克隆：从经过阴性和阳性筛选后的洗脱物中随机挑选出100个噬菌体单克隆,通过ELISA技术进一步鉴定其与尘螨IgE结合的特异性,结果得到84个能与尘螨IgE特异性结合的噬菌体。3、DNA测序与多肽合成：将84个噬菌体克隆进行DNA测序后,除去相同序列以及克隆无效的序列,最后获得44个噬菌体克隆。将这44个噬菌体单克隆的DNA序列与尘螨主要变应原分子Der p1, Der p2, Der p5与Der p7的三维结构通过软件比对,将3个特异性强且氨基酸序列与尘螨主要变应原比对性高的噬菌体单克隆合成模拟肽。二、户尘螨模拟环肽对实验性变应性鼻炎伴支气管哮喘模型的作用以户尘螨诱导的变应性鼻炎伴哮喘的小鼠为模型,观察3个合成模拟肽在体内对变应性鼻炎伴支气管哮喘的干预作用,设正常对照组,变应性鼻炎伴哮喘模型组以及模拟肽干预组1/2/3。100μ1户尘螨提取液滴鼻致敏后,正常对照组以生理盐水滴鼻激发,模型组与模拟肽干预组以100μ1户尘螨提取液激发。模拟肽干预组采用合成肽(500μg合成肽+200μ1 PBS)溶液皮下注射连续给药干预(1次／天)4天。再次激发后处死小鼠,进行一系列观察与检测,结果如下：1、模拟肽干预组小鼠的抓鼻、流清涕、打喷嚏的症状明显改善,无口唇发绀、喘气以及呼吸频率加快等症状。2、模拟肽干预组气道阻力较模型组明显降低。3、模拟肽干预组鼻黏膜上皮细胞完整,无柱状和杯状细胞增生,黏膜下层无腺体增生、无中性粒细胞、淋巴细胞浸润,仅有少量嗜酸性粒细胞；模拟肽干预组肺组织血管与支气管炎症浸润明显减少、气道上皮结构好转。4、模拟肽干预组1、2、3鼻黏膜上皮IL-25mRNA、IL-33mRNA水平明显低于模型组；模拟肽干预组肺组织中IL-25mRNA、IL-33mRNA水平明显低于模型组。5、模拟肽干预组鼻腔与支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞均显著低于模型组。6、鼻腔灌洗液：模拟肽干预组IL-4水平明显低于模型组,干预组2、3 IL-10水平明显高于模型组,干预组3中IL-25水平明显低于模型组,干预组IFN-γ水平明显高于模型组；肺泡灌洗液：模拟肽干预组IL-4水平明显低于模型组,干预组1、3 IL-10水平明显高于模型组,干预组IL-25水平明显低于模型组,干预组1、2中IL-33水平明显低于模型组,干预组1、3中IFN-γ水平明显高于模型组。7、模拟肽干预组血清户尘螨特异性IgE抗体水平明显低于模型组,而IgG1抗体水平则明显高于模型组。综上所述,应用噬菌体展示技术成功筛选到尘螨B细胞表位模拟肽,且筛选到的模拟肽能显著减轻尘螨诱导小鼠变应性气道炎症的病理损伤,改善症状,有效抑制鼻腔与肺组织中炎性细胞的浸润,减少促炎细胞因子的分泌,降低尘螨特异性IgE水平,提高保护性抗体IgG1水平。本研究为进一步研制和开发尘螨特异性免疫治疗的表位疫苗提供实验依据。
[Abstract]:In order to verify the biological function of IgE - specific binding peptide in serum of dust mite allergen - positive patients , we obtained 84 phage clones which can bind to the IgE - specific IgE antibody .
The levels of IL - 25 mRNA and IL - 33mRNA were significantly lower than those in model group .
The levels of IL - 25 mRNA and IL - 33mRNA were significantly lower in the model group than those in the model group . The levels of IL - 4 in the nasal cavity and the bronchial alveolar lavage fluid were significantly lower than those in the model group .
In conclusion , the levels of IL - 4 in the intervention group were significantly lower than those in the model group and the levels of IL - 25 in the intervention group were significantly lower than those in the model group .

【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392-33

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