大肠杆菌S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（SAHN）的功能性研究及其药物虚拟筛选

发布时间：2018-05-18 18:12

本文选题：S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN) + 群感效应　；参考：《济南大学》2017年硕士论文

【摘要】：目前,在感染病领域由耐药细菌引起的疾病感染是全球正在关注的热点。对药物的作用靶点结构进行修饰可以通过甲基化过程来实现,这是致病菌一种重要的耐药机制。S-腺苷甲硫氨酸(SAM)在细胞中是一种通用的甲基供体,在甲基循环中起着非常重要的作用,如果某些关键的蛋白质与SAM的生化代谢途径相关,那么此蛋白质有可能成为一种药物靶点。在甲基转移酶催化作用下,S-腺苷高半胱氨酸(SAH)由甲基供体SAM参与去甲基化反应生成。SAH在转甲基化反应过程是一种有效的竞争性抑制剂,对细胞内的核酸和蛋白质有强烈的毒性,能抑制它们的修饰过程。在哺乳动物细胞内,SAH在S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)作用下发生水解反应,只需要一步就生成产物高半胱氨酸和腺苷酸,而在大多数病原微生物的细胞内没有表达SAHH蛋白的能力,SAH只能是在S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)和S-核糖基高半胱氨酸酶(LuxS)两种酶的参与下发生催化分解反应,生成腺嘌呤和高半胱氨酸。另外,经甲基修饰的供体SAM发生甲基化反应后除生成SAH还能生成甲硫腺苷(MTA)。在很多致病性的病原微生物中,MTA在S-腺苷高半胱氨酸/甲硫腺苷核苷酶(SAHN)作用下发生分解反应,生成腺嘌呤和5′-甲硫核糖(MTR),MTR立即进入下一步反应,在5′-甲硫核糖激酶(MTR Kinase)作用下发生磷酸化反应,生成的产物是5′-甲硫核糖-1-磷酸(MTRP)。但是,在致病菌的宿主哺乳类等真核细胞内,MTA是通过不同的途径来进行反应的,在5′-甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)催化作用下生成MTRP和腺嘌呤。病原微生物和宿主细胞在是SAH代谢节点和MTA代谢节点的不同,使得在致病菌中特有的能分解SAH和MTA反应的SAHN核苷酶成为抗感染药物的一个具有潜力的分子靶标。本论文利用Red/ET同源重组法敲除大肠杆菌MG1655的sahn基因,通过同源重组双交换的方法用卡那霉素抗性基因取代基因组中整个sahn基因的编码序列。转入重组酶表达质粒以消除抗性筛选标记,得到保留单一LoxP位点的突变菌株△sahn。同时,本论文成功构建重组表达载体pET-28a-sahn。以IPTG作为诱导剂进行诱导表达,并通过Ni-NTA亲和层析对SAHN酶蛋白进行纯化。用考马斯亮蓝法测定经除盐浓缩后的蛋白含量约为368?g/m L,根据米氏方程双倒数法计算SAHN酶蛋白的酶促反应动力学参数Vmax和Km。实验研究还发现SAHN酶蛋白在不同的表达水平下,群感效应的表征信号分子AI-2和菌膜的形成均有所差异。最后,采用分子对接技术从小分子数据库中筛选到一种新型抑制剂,并模拟小分子抑制剂与受体SAHN酶蛋白的相互作用。小分子抑制剂与受体SAHN酶蛋白的相互作用是分子相互识别的过程,主要作用力包括氢键作用、静电作用、疏水作用、范德华力作用等。通过计算来预测两者间的模式结合亲和力,进行药物的虚拟筛选,从而为发展以SAHN为药物靶点的可行性提供理论和实验上的依据和参考。
[Abstract]:In the presence of S - adenosylhomocysteine hydrolase ( SAHN ) , the MTA is a potent competitive inhibitor .
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R378;R91

【参考文献】