帕金森病模型大鼠神经损伤蛋白标志物及疾病早期诊断的候选物研究

发布时间：2018-05-26 22:15

本文选题：帕金森病 + 内源性神经毒素　；参考：《北京理工大学》2015年博士论文

【摘要】：帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是世界上第二大神经退行性疾病，主要表现为损害患者的运动机能，出现静止性震颤、肌强直、运动缓慢等临床症状，因此严重影响患者的生活质量。自从发现外源性神经毒素MPTP可以造成多巴胺能神经元特异性死亡之后，内源性MPTP结构类似物越来越受到关注，特别是在脑内由多巴胺代谢生成的儿茶酚胺异喹啉（catecholamine isoquinolines，CAIQs）物质。本实验室在多年研究基础上，提出了CAIQs在脑内形成与代谢的假说，其中由氮甲基转移酶催化salsolinol（Sal）生成氮甲基产物N-methy-salsolinol （NMSal）是造成神经毒性显著增强的关键步骤。基于此假说，进一步开展内源性神经毒素对黑质神经元损伤分子机制研究，并发展早期诊断的生物标志物候选物，将有助于为PD的发病机制、早期诊断研究提供理论基础。本课题围绕PD中神经损伤相关蛋白标志物和疾病早期诊断标志物的候选物研究，开展两方面的工作：基于Sal氮甲基转移酶（SNMT）在内源性神经毒素形成神经元损伤中的关键作用，发展基于质谱技术的多反应监测定量方法，以达到对SNMT活性高灵敏度和高选择性测定和进一步验证假说的目的，为后续开展生物标志物的分析检测建立方法学基础；另一方面，通过18O标记的定量蛋白质组学方法开展神经功能损伤差异蛋白质组学研究，为了解疾病相关的神经功能变化提供蛋白质组学的概貌，并通过脑部与外周差异蛋白的相关性分析，为后续临床诊断生物标志物的筛选提供参考。主要研究内容和研究结果如下： 1、针对SNMT酶活测定中的产物NMSal，开展基于多反应监测（Multiple reactionmonitoring，MRM）技术的儿茶酚异喹啉类化合物NMSal的高灵敏度定量方法。质谱检测离子对为NMSal （194.1→145.1），方法学的评价表明NMSal的最低检测限达49pM，最低定量限为98pM，定量范围在0.098nM~100nM，线性相关系数大于0.9995，具有较好的日内精密度和日间精密度（均小于15.0%），较好的准确度（94.0%~112.5%），以及较好的方法回收率（81.0%~91.4%），保证了在复杂生物体系中对NMSal的高灵敏度、高选择性以及高准确性的定量检测要求。 2、通过对NMSal的定量检测，测定了6-OHDA单侧损毁的PD模型大鼠中SNMT活性。其中PD模型大鼠采用6-OHDA单侧损毁纹状体的方式构建，通过行为学和形态学的评价结果显示建模成功率达60%，模型组黑质部位多巴胺能神经元数目与假手术对照组相比显著减少（p0.01）。SNMT活性的结果发现PD模型大鼠纹状体、黑质和血液淋巴细胞中SNMT活性与假手术对照大鼠相比均显著升高（纹状体：p0.05；黑质与淋巴细胞：p0.01），活性在外周淋巴细胞变化趋势与在脑部变化的趋势一致，该结果不仅说明SNMT及其活性与CAIQs在脑内形成与代谢有关，而且进一步证实SNMT的活性可能在外周血液中有所反映，有可能作为早期诊断的标志物。 3、开展了抑制off-gel分离中18O标记回标的方法研究。对标准蛋白牛血清白蛋白BSA的考察结果表明，通过超滤去除游离酶后，18O标记的肽段在off-gel分离中没有出现明显回标现象，标记效率为95.5±2.5%，肽段的平均回收率为80.6±10.8%，16O与18O标记的肽段混合物1:1混合后的比值为0.99±0.17。此外，生物样品经过超滤法去除游离酶和off-gel分离之后，90%以上的蛋白定量比值为1.04±0.16，满足定量蛋白质组学的要求，有助于定量蛋白质组学中18O标记方法与off-gel分离的联用。 4、采用基于18O标记的二维液相色谱质谱法，对6-OHDA单侧损毁的PD模型大鼠中纹状体和黑质的蛋白进行差异蛋白质组学、及疾病状态下神经损伤的分子机制的深入研究。纹状体的蛋白质组学结果显示当肽段FDR1.0%时，共有1232张肽段-质谱匹配图，以及370个蛋白得到定性和定量分析，76个蛋白差异表达；黑质的蛋白质组学结果显示当肽段FDR1.0%时，共有8349张肽段-质谱匹配图，以及1344个蛋白得到定性和定量分析，93个蛋白差异表达。通过生物信息学软件分析和文献对数据的支持与解读，并基于单侧损毁的PD模型大鼠中纹状体和黑质的氧化应激水平增高现象，发现与神经功能损伤相关的蛋白变化情况主要体现在：（1）参与糖酵解过程的蛋白和线粒体蛋白分别表达上调和表达下调，包括纹状体中7个线粒体蛋白表达下调，3个参与糖酵解过程的蛋白表达上调，黑质中5个线粒体蛋白表达下调，3个参与糖酵解过程的蛋白表达上调，与PD密切相关的这两个脑区中均显示出糖酵解和线粒体功能的蛋白水平协同的差异表达，提示疾病过程中的能量代谢发生障碍，线粒体功能受损，ATP供能不足，糖酵解过程的蛋白表达上调以发挥能量代偿作用；（2）纹状体中22个下调蛋白是囊泡组分，含10个参与神经元囊泡的传递和回收组分，这些蛋白构成以SNARE复合体为核心的突触蛋白及其附属蛋白，和以网格蛋白介导的胞吞过程相关蛋白，并对突触融合蛋白（syntaxin-1A）进行了生物学验证，与质谱结果一致，表明6-OHDA单侧损毁的PD大鼠模型中，其纹状体的胞吞胞吐功能受损，参与了疾病的发病进程；（3）黑质的差异表达蛋白显示13个蛋白在免疫应答生物学过程中显著聚集，包括小胶质细胞发生细胞活化和增殖的蛋白3个、炎症反应与免疫蛋白8个、维持钙平衡和神经保护作用的蛋白2个，其中对血清白蛋白（serum albumin）进行生物学验证，验证结果与质谱结果一致，免疫相关蛋白的差异表达提示随疾病进程中关键病变区的免疫功能异常。 5、基于18O标记的差异蛋白质组学对6-OHDA单侧损毁的PD大鼠模型中血液淋巴细胞的研究发现，淋巴细胞中参与糖酵解过程的蛋白表达上调，免疫应答相关的蛋白表达上调，此外，与假手术对照组相比，PD模型组的大鼠白细胞数目和淋巴细胞数目极显著增加（p0.01），表明疾病状态下机体存在炎症反应，对大鼠的外周血淋巴细胞进一步的细胞亚群分型可以发现，CD4+/CD8+的比值降低（p0.01），提示疾病进程中机体活跃的免疫反应，存在免疫功能异常，并且主要是由T辅助细胞（CD4+）的百分比降低所致；外周和脑部差异蛋白的相关性分析结果发现共17个蛋白在淋巴细胞和黑质部位差异表达，相关系数为0.45，说明这17个差异蛋白在外周和脑部的变化具有一致性，存在一定的相关程度，其中在外周与脑部的表达均为上调的差异蛋白共7个，变化趋势的相关系数为0.89，进一步说明外周与脑部差异蛋白表达水平的趋势一致，相关程度增加，外周淋巴细胞蛋白的变化能够反映出脑部的蛋白变化，同时主成分分析可以发现，果糖二磷酸醛缩酶A、甘油醛3-磷酸脱氢酶、6-磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶在淋巴细胞中表达上调，在黑质中无明显差异表达，提示疾病发生过程中，，外周淋巴细胞对能量需求的敏感性高，以发挥其免疫监视、免疫应答的作用，纤维蛋白原、血清白蛋白、补体C3、转凝蛋白-2和α-辅肌动蛋白均表现为外周与脑部表达上调的趋势，并且蛋白变化的相关系数为0.95，提示免疫功能相关蛋白参与了疾病的发病进程，表现为外周和脑部均存在免疫反应，其蛋白水平能够反映外周与脑部变化趋势，可为后续临床诊断指标提供研究基础和候选参考。综上所述，基于质谱技术手段，不仅能够准确定量单一目标，也能反映生物机体内整体蛋白质的表达情况概貌。从蛋白质的水平表征疾病进程中的变化，包括神经功能损伤和疾病标志物的研究，对提高早期诊断的正确率、合理分类亚型、监测病情进展和评估神经保护治疗的疗效具有重要作用，可作为后续研究的参考。
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【学位授予单位】：北京理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.5;R-332

【参考文献】