Sufu伴随Gli蛋白产生Shh信号的转录应答
本文选题:Hedgehog + Sufu ; 参考:《南京医科大学》2015年博士论文
【摘要】:Hh蛋白家族调控着一系列发育的过程和肿瘤的产生,Hh通路的失调在发育紊乱和癌症中均有作用。例如,对于指导从四肢到中枢神经系统发育、基底细胞癌和髓母细胞瘤的产生,具有深远的影响。美国药监局批准的对抗BCC转移的Hh通路抑制剂表明了Hh在癌症治疗中的重要性;而且对于其它癌症的研究,许多临床试验仍在开展当中。Hh是一个形态发生因子,它沿着发育轴线形成浓度梯度而发挥作用。在神经管发育过程中,它从脊索和底板中表达,并且一直延伸到背部。Hh蛋白是Ptch的配基。Ptch是一种12次跨膜蛋白,它能反向调节7次跨膜蛋白Smo。Hh配基与Ptch结合,导致Smo的激活。这将导致Smo转运至原纤毛中,Hh通路也得以正常转运。Smo的下游是Gli家族,它们是一组锌指转录因子。在哺乳动物中具有三个同源蛋白,Gli1、Gli2和Gli3。Sufu作为Gli蛋白的分子伴侣,能够与所有的Gli蛋白结合而形成复合物。Sufu能够与Gli氨基端高度保守的SYGH结构域结合,又或者通过遮挡Gli的核输入信号(NLS),从而将Gli阻滞在细胞浆中,使得Gli蛋白被Sufu抑制。然而现在并不清楚Sufu对于调节Gli胞浆阻滞的具体机制。随着Hh的刺激,Gli蛋白转运至细胞核中,暗示Sufu对于Gli在胞浆中的锚定功能被解除了。然而,生物化学和遗传学研究表明Sufu调节Gli的活性是通过其它非胞浆阻滞机制。这就暗示Sufu与Gli蛋白在细胞核中仍然能够结合。然而,Sufu调控Gli蛋白的详细机制还不明确。由于Hh在小脑发育中起到十分重要的作用,我们利用小脑为模型进行研究。在成年小鼠小脑中,Hh通路是处于静息状态,但是在出生一周多之后,小脑发育处于高强度,Sufu的水平与Gli一样,在外胚层颗粒神经元前体中表达都很高。这部分细胞的发育高度依赖hh信号的输出。在髓母细胞瘤这一来自于颗粒神经元前体的小脑肿瘤中,hh通路被重新激活,与之前一样的是,sufu的水平同gli1一致高度上调。除此之外,sufu在细胞核和细胞浆中均有定位。为了进一步观察sufu在细胞核和细胞浆中的分布,我们检测了小鼠胚胎成纤维细胞系(mefs)。在正常的mefs中,无论shh处理与否,sufu在胞核和胞浆中均有分布。当我们检测gli2/3缺失的细胞时,令我们惊讶的是sufu在没有shh时几乎处于细胞浆中。而当有shh时,sufu被诱导至细胞核中,在gli2/3缺失的细胞中是不存在抑制子的。这就暗示在正常mefs中,在没有shh处理的情况下,sufu很有可能是被抑制子带入到细胞核的。在gli2/3缺失的细胞中,shh诱导sufu入核是由gli1介导的。为了证明这一点,我们在gli2/3缺失的细胞中稳定表达gli1的shrna,从而构建三种gli都没有的细胞系。在这种细胞系中,sufu的入核不再受到shh的诱导。sufu能够招募sin3a和hdac从而抑制gli的转录活性。我们重新考虑了这个模式并且探究sufu能否出现在gli结合位点的染色质上。我们以gli1和ptch1的启动子为例,利用chip实验,两个位点在shh处理之后,gli结合元件的含量增加,暗示shh能够诱导sufu招募至其靶基因启动子区域。有趣的是,我们同样发现sap18在hh的靶基因启动子上,hh能够促使其从染色质上脱落。这些结果暗示hh能够诱导gli1-sufu复合物附着在它的靶基因启动子区域,而且这是依赖于gli1和gli3抑制子。为了找到决定sufu在胞浆和胞核中分布的序列原件,我们做了缺失定位,最后确定在人类sufu的308-318残基中具有潜在的nes信号。我们将其中两个亮氨酸突变成丙氨酸并且在mefs中进行检测。相比于野生型的sufu,nes突变的sufu更多的出现在细胞核中。而且nes的受体crm1也不再与突变的sufu结合。本实验室之前报道了一个pka和gsk3β双磷酸化位点能够调节sufu的稳定性和原纤毛转运。这个双磷酸化位点正好处于nes的附近。在coip实验中,我们发现在342或者346位点不能被磷酸化而突变的sufu与crm1具有有效的结合能力,而模拟磷酸化的sufu则失去了与crm1结合的能力。最后,我们将正常Sufu-GFP与GSK-3β、PKA单独或者二者联合共转染,发现更多的Sufu在细胞核中,但是这些激酶对非磷酸化的Sufu,即双A突变并不能起到作用。上述结果阐明了Sufu不仅能够参与Gli介导的转录、抑制信号通路,同时还能通过提高Gli1蛋白的细胞核转运和稳定性,从而提高Hh通路活性,这对于Shh通路的最大化激活是必须的。使我们对于Sufu作为Gli蛋白分子伴侣有了新的认识。
[Abstract]:The Hh protein family regulates a series of developmental processes and tumours, and the maladjustment of the Hh pathway plays a role in development disorders and cancers. For example, it has a far-reaching impact on the development of the limb to central nervous system, basal cell carcinoma and medulloblastoma. The Hh pathway approved by the United States Drug Administration to combat BCC metastasis The preparation shows the importance of Hh in cancer treatment; and for other cancers, many clinical trials are still developing in which.Hh is a morphogenetic factor that forms a concentration gradient along the development axis. In the process of neural tube development, it is expressed from the chord and the floor and extends to the back.Hh protein. The Ptch ligand.Ptch is a 12 transmembrane protein, which can reverse the 7 transmembrane protein Smo.Hh ligand binding with Ptch and lead to Smo activation. This will lead to the transport of Smo into the primary cilia, and the Hh pathway is also the downstream of the normal transport of.Smo, which is a group of zinc finger transcription factors. In mammals, there are three homologous proteins, Gli, Gli. 1, Gli2 and Gli3.Sufu, as a molecular chaperone of Gli protein, can bind to all Gli proteins and form complex.Sufu to bind to the highly conserved SYGH domain of the Gli amino terminal, or by blocking the nuclear input signal (NLS) of Gli, so that Gli is blocked in the cytoplasm, making Gli protein suppressed by Sufu. U is a specific mechanism for regulating Gli cytoplasmic block. With the stimulation of Hh, Gli protein is transported to the nucleus, suggesting that Sufu has been relieved of the anchoring function of Gli in the cytoplasm. However, biochemical and genetic studies have shown that the activity of Sufu to regulate Gli is through other non cytoplasmic blocking mechanisms. This implies that Sufu and Gli proteins are in the nucleus. However, the detailed mechanism of the Sufu regulation of Gli protein is still unclear. Since Hh plays a very important role in the development of the cerebellum, we use the cerebellum as a model to study. In the cerebellum of adult mice, the Hh pathway is resting state, but after more than one week of birth, the cerebellum is in high intensity, the level of Sufu and Gl The expression of I is high in the precursor of the ectodermal granular neurons. The development of this part of the cells depends on the output of the Hh signal. The Hh pathway is reactivated in the medulloblastoma, a cerebellar tumor, which comes from the precursor of granular neurons. As before, the level of Sufu is up to the same level as Gli1. In addition, Sufu is in the cell. In order to further observe the distribution of Sufu in the nucleus and cytoplasm, we detected the mouse embryonic fibroblast line (MEFs). In normal MEFs, no matter Shh treatment or not, Sufu is distributed in the nucleus and cytoplasm. When we detect the cells missing from gli2/ 3, we are surprised that Sufu is not. Shh is almost in the cytoplasm. And when there is Shh, Sufu is induced into the nucleus, and there is no suppressor in the gli2/3 missing cells. This suggests that in normal MEFs, in the absence of Shh treatment, Sufu is likely to be brought into the nucleus by the suppressor. In gli2/3 missing cells, shh induced Sufu entry is Gli1. Mediated. In order to prove this, we stably express Gli1 shRNA in gli2/3 missing cells, thus constructing three cell lines with no Gli. In this cell line, Sufu's nucleation is no longer induced by SHH induced.Sufu to recruit sin3a and HDAC to inhibit Gli transcriptional activity. We reconsidered this pattern and explored su. Fu can appear on the chromatin of the Gli binding site. We take the promoter of Gli1 and PTCH1 as an example, using the chip experiment, after the two loci are treated with Shh, the content of the Gli binding element increases, suggesting that Shh can induce Sufu to recruit to its target gene promoter region. Interestingly, we also found sap18 in Hh target gene promoter. HH These results suggest that Hh can induce the gli1-sufu complex to attach to its target gene promoter region, and that this is dependent on the Gli1 and Gli3 suppressors. In order to find the sequence originals that determine the distribution of Sufu in the cytoplasm and nucleus, we have made the missing location and finally determined the 308-318 residue of Sufu in human beings. The base had a potential NES signal. We mutated two of the leucine into alanine and detected in MEFs. Compared to the wild type sufu, the Sufu of the NES mutation appeared more in the nucleus. And the NES receptor CRM1 was no longer associated with the mutation of sufu. A pKa and GSK3 beta diphosphorylation site was reported before this laboratory. It is possible to regulate the stability of Sufu and the transport of the primary cilium. This diphosphorylation site is just near nes. In the CoIP experiment, we found that sufu, which can not be phosphorylated at 342 or 346 sites, has an effective binding ability with CRM1, and the simulated phosphorylation of Sufu loses its ability to bind with CRM1. Finally, we will have normal Su. Fu-GFP was co transfected with GSK-3 beta, PKA alone or two, and found that more Sufu was in the nucleus, but these kinases did not play a role in the non phosphorylated Sufu, that is, double A mutation. These results illustrate that Sufu can not only participate in Gli mediated transcription, inhibit the signaling pathway, but also enhance the nuclear transport of Gli1 protein. And stability, thus enhancing the activity of the Hh pathway, which is necessary for maximizing the activation of the Shh pathway. We have a new understanding of Sufu as a molecular chaperone of the Gli protein.
【学位授予单位】:南京医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R363
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,本文编号:1962635
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