嵌合型轮状病毒与肠道病毒71型病毒样颗粒的重组杆状病毒表达载体的构建

发布时间：2018-06-06 22:57

本文选题：轮状病毒 + 肠道病毒71型　；参考：《南阳师范学院》2017年硕士论文

【摘要】：人轮状病毒(Human rotavirus, HRV)是引起婴幼儿腹泻的最主要病原体之一,几乎所有5岁以下儿童都被感染过至少一次,是造成发展中国家婴幼儿死亡的重要病因。这两种病毒严重威胁着人类健康和公共安全。这两种疾病目前尚无有效的治疗药物,使用减毒活疫苗和灭活疫苗进行免疫仍是预防和控制这两种疾病的主要措施。但是,减毒活疫苗可能会发生基因重组和毒力返强,灭活疫苗则很少甚至无法诱导产生细胞免疫,而且存在着灭活不彻底的潜在风险,使得这两种疫苗都无法达到理想的效果。因此,开发针对轮状病毒与肠道病毒71型的新型基因工程疫苗具有十分重要的意义。病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)由病毒结构蛋白自我组装形成,在形态结构上与真实病毒粒子高度相似,可以高效的诱导体液免疫和细胞免疫,而且由于不含病毒核酸而具有良好的安全性,因此VLPs近年来已经成为一种理想的候选基因工程疫苗。这些发现为研发新的嵌合型轮状病毒与肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗奠定了理论基础。实验室前期研究已经证实,轮状病毒的VP2、VP6和VP7同时在Sf9细胞中表达会组装成三层病毒样颗粒,并且具有良好的免疫效果。此外,有研究发现,轮状病毒的VP4可以帮助VLPs有效地进入肠道细胞,EV71的主要抗原VP1展示于VLPs表面可以诱导产生高水平的抗体,并具有良好的免疫保护效果。实验首先利用PCR技术扩增获得轮状病毒的VP2、VP4、VP6、VP7基因和肠道病毒71型的VP1基因,并利用融合PCR技术将EV71 VP1基因通过柔性接头与截短的RVVP2基因相融合,得到融合基因ER1,2。将测序验证正确的病毒结构基因分别克隆入转移载体pFBDM-IM和pUCDM-XIGP中,得到的重组转移载体通过Tn7和Cre-LoxP重组至杆状病毒Bacmid中,然后将重组Bacmid转染Sf9细胞获得重组病毒。重组病毒再次感染Sf9细胞72小时后用荧光显微镜进行观察,发现Sf9细胞出现明显的细胞病理变化,如细胞明显变大,细胞增殖不明显或者不增值,有细胞脱落的现象,倒置荧光显微镜下观察有较多的荧光,证实了重组杆状病毒的成功构建。提取重组杆状病毒基因组DNA并用RV和EV71病毒基因的特异性引物进行PCR鉴定,结果表明外源病毒基因已经成功重组至杆状病毒基因组中。随后用SDS-PAGE电泳和Western blot检测外源基因的表达情况,结果显示VP2、VP6、 VP7、ER1,2蛋白大小分别为104KDa、46KDa、38KDa、127KDa。蛋白条带较为单一且蛋白大小与预期一致,由此可见病毒样颗粒的相关基因已正确表达,这为以后疫苗的研究和开发奠定了基础。
[Abstract]:Human rotavirus ( VP4 ) is one of the main pathogens causing infant diarrhea . Almost all children under the age of 5 have been infected at least once , which is an important cause of infant death in developing countries .
【学位授予单位】：南阳师范学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392

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