人脐带间充质干细胞来源的外泌体免疫调节功能异质性的研究

发布时间：2018-06-10 12:19

本文选题：外泌体 + 间充质干细胞　；参考：《河北北方学院》2017年硕士论文

【摘要】：间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)对适应性免疫和获得性免疫均有一定的调节功能,成功运用于治疗移植物抗宿主病(Graft-Versus-Host Disease,GVHD)后迅速被临床上用于治疗其他免疫相关疾病。既往对MSC的作用机制研究发现,其功能受到细胞的来源,体外培养条件,输入体内后的微环境等多方面因素的影响。大量的临床实验证明MSC在临床上治疗GVHD的疗效具有很大差异。通过静脉输入体内后的MSC很难继续存活,而主要依靠其旁分泌作用发挥功能,其中外泌体是重要的作用介质。现已有实验证实了外泌体参与MSC的免疫调节过程。但外泌体体积较小,直径只有30nm~100nm,现有的提取方法尚不能快速,高效的制备外泌体。MSC的疗效差异是否跟外泌体免疫调节能力有差异有关,尚缺乏相关的研究。本研究通过以下实验,对该问题进行探索。选择空军总医院2015-01至2015-05健康产妇的脐带所提取的脐带MSC细胞(Human umbilical cord-MSCs,hUC-MSCs),扩增代数为P3-P5。将MSC细胞分为5组,分别使用终浓度为2%、4%、6%、8%、10%的聚乙二醇6000(Polyethylene glycol 6000,PEG6000)提取无血清MSC培养上清中的外泌体(h UC-MSCs-ex),利用透射电子显微镜及流式细胞术对所得的物质进行鉴定,比较各组蛋白质的含量。从入组的MSC中随机选取5株不同供者来源的hUC-MSCs,收集无血清培养上清用PEG6000提取外泌体。分离健康供者肝素抗凝脐带血中的单个核细胞(Umbilicalcord blood mononuclear cells,UBMCs)。根据hUC-MSCs-ex来源不同分5大组(A、B、C、D、E)进行实验,每组分为5小组进行组间对比研究,进一步观察UBMCs增殖、分泌及对K562细胞杀伤作用的影响,分组为:阴性对照组,阳性对照组,实验组1,实验组2,实验组3。均选用含血清的RPMI 1640培养基,阴性对照组为空白组;阳性对照组、实验组1、2、3添加UBMCs激活物:刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)、重组白介素2(rhIL-2);实验组1、2、3加入同一供者,不同浓度的(2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)hUC-MSCs-ex共培养。相同的分组将5株不同来源hUC-MSCs-ex和UBMCs共培养,观察UBMCs增殖,分泌,对K562细胞杀伤作用的变化。通过研究发现使用PEG6000提取的外泌体在透射电子显微镜下呈圆形,直径在30nm~100nm左右,表达CD9,CD63,CD81及CD44,提示提取的物质属于MSC分泌的外泌体。用8%终浓度的PEG6000提取hUC-MSCs-ex的总蛋白的量最佳,为837±107μg/1×107cells。在抑制细胞增殖方面,外泌体的来源和浓度因素之间无交互作用(F=1.033,P0.05)。不同来源,不同浓度的hUC-MSCs-ex对UBMCs增殖抑制能力均有统计学差异(F=77.362,P0.01;F=13.862,P0.01)。其中C#hUC-MSCs-ex各个浓度的抑制能力均高于其他实验组。在抑制细胞分泌IFN-γ,TNF-α方面,不同来源,不同浓度的hUC-MSCs-ex的抑制能力均有统计学差异(F=63.390,P0.01;F=14.605,P0.01)。不同浓度的hUC-MSCs-ex抑制UBMCs分泌的能力有统计学差异,其中A#hUC-MSCs-ex各个浓度的抑制能力均高于其他实验组。在抑制细胞杀伤能力方面,浓度为2μg/ml,5μg/ml的不同来源的外泌体对UBMCs杀伤能力的影响具有差异性(F=12.576,P0.05;F=8.702,P0.05),其中D#hUC-MSCs-ex的抑制能力均高于其他实验组。综上,我们的研究发现:使用终浓度为8%的PEG6000可快速,高效地制备外泌体。不同供者来源hUC-MSCs-ex在免疫调节方面具有异质性。
[Abstract]:MSC cells ( MSC ) were used to treat other immune - related diseases rapidly after graft - host disease ( GVHD ) . The effects of proliferation , secretion and anti - tumor effects on K562 cells were observed . The results showed that there was no interaction between different concentrations of hUC - MSCs - ex and other experimental groups .
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392

【参考文献】