DNA免疫研制艰难梭菌外毒素A和B单克隆抗体及抗体基因序列分析

发布时间：2018-06-13 19:48

  本文选题：DNA免疫 + 单克隆抗体　； 参考：《南京医科大学》2015年博士论文

【摘要】：第一部分艰难梭菌外毒素A单克隆抗体的研制及抗体特性研究目的:利用DNA免疫平台,研制针对艰难梭菌外毒素A(Clostridium difficile toxin A,Tcd A)抗原的高亲和力的单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab,缩写成单抗),并研究其特异性和抗毒素活性等相关特性,为艰难梭菌Tcd A实验室诊断和免疫治疗提供依据。方法:以表达Tcd A羧基端受体结合区(Tcd A-C)的DNA疫苗为免疫原,利用DNA初免结合蛋白加强免疫的免疫策略,将免疫后的BALB/c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合产生杂交瘤。通过Tcd A抗原捕获ELISA筛选产生抗原特异的杂交瘤细胞,用有限稀释法筛选单克隆抗体的杂交瘤细胞。用ELISA分析,确定单克隆抗体识别的抗原表位。通过细胞功能试验和小鼠毒素攻击保护试验,研究Tcd A-C特异的单克隆抗体保护作用。结果:经过5轮筛选和分析,本课题最终获得6株Tcd A特异的具有高度亲和力和高度特异性的杂交瘤细胞株,这些细胞株能稳定分泌针对Tcd A-C的单克隆抗体。研究表明,除了1株单抗(1G3F10)为Ig G1外,其余5株单抗均为Ig G2a。CHO细胞和小鼠毒素攻击保护试验表明,3株单抗(2C7B6,5D8D5和4A4F2)具有部分保护功能,保护细胞和小鼠免受Tcd A毒素攻击作用。m Ab 1G3F10和5D8D5识别共同的抗原决定簇,m Ab 2D4D3、4A4F2、2C7B6和1B5F5识别另一个抗原决定簇。最终5D8D5包被和HRP-2C7B6检测成功配对形成诊断试剂盒,可以检测临床分离株中毒素的分泌量。结论:通过DNA免疫成功制备Tcd A特异的单抗,具有一定的保护作用。利用2株高亲和力的单克隆抗体,研制出艰难梭菌外毒素A的诊断试剂盒。第二部分艰难梭菌外毒素B单克隆抗体的研制及抗体特性研究目的:利用DNA免疫平台,研制针对艰难梭菌外毒素B(Clostridium difficile toxin B,Tcd B)抗原的高亲和力的单克隆抗体,并研究其特异性和抗毒素活性等相关特性,为艰难梭菌Tcd B实验室诊断和免疫治疗提供依据。方法:以表达Tcd B氨基端(Tcd B-N)或羧基端(Tcd B-C)的DNA疫苗为免疫原,利用DNA初免结合蛋白加强免疫的免疫策略,将免疫后的BALB/c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合产生杂交瘤。通过Tcd B抗原捕获ELISA筛选产生抗原特异的杂交瘤细胞,用有限稀释法筛选单克隆抗体的杂交瘤细胞。用ELISA分析,确定单克隆抗体识别的抗原表位。结果:经过筛选和分析,最终获得12株具有高度亲和力和高度特异性的杂交瘤细胞株,其中9株细胞株能稳定分泌针对Tcd B-C的单克隆抗体,其中3株细胞株能稳定分泌针对Tcd B-N的单克隆抗体。特性分析表明,其中单抗7G1F2、4A9E3和1D5B3为Ig G2a,4B4B1为Ig G2b,其余8株单抗为Ig G1。最终7E2G3包被和HRP-4A9E3检测成功配对形成诊断试剂盒,可以检测临床分离株中Tcd B毒素的分泌量。结论:通过DNA免疫免疫成功制备Tcd B-N和Tcd B-C特异的单抗。利用2株高亲和力的单克隆抗体,研制出艰难梭菌外毒素B诊断试剂盒。第三部分DNA免疫制备的针对多种抗原的单克隆抗体Ig基因克隆及抗体序列分析目的:利用DNA免疫平台,制备针对多种感染性病原的单克隆抗体,并鉴定其相关特性。克隆并分析这些单克隆抗体的全长基因序列,分析DNA免疫对小鼠B细胞发育成熟的影响。方法:以表达流感H5-VN HA、H7-ZJU01 HA或HIV Gag-C8的DNA疫苗分别为免疫原,利用DNA初免结合蛋白加强免疫或者细胞加强免疫的免疫策略,免疫后的BALB/c小鼠脾细胞经过与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过ELISA对杂交瘤细胞进行筛选和鉴定。获得的杂交瘤细胞株利用RNA连接酶介导的c DNA末端快速扩增(RNA ligase mediated rapid-amplification of c DNA ends,RLM-RACE)技术扩增Ig的全长基因序列。结果:在获得的众多单抗中,选择具有代表性13株杂交瘤细胞株,通过RLM-RACE技术最终得到各自的重链和轻链的全长基因序列。分析这些序列以及CDR3的序列的变化,可以看出轻链的CDR3区长度固定,变异度小,而重链CDR3区的长度长并且变异度大。结论:利用DNA免疫成功制备针对多种感染性疾病病原的小鼠的单克隆抗体并通过RACE获得单克隆抗体的基因序列,该技术平台是分析小鼠B细胞发育成熟的非常有用的工具。
[Abstract]:A monoclonal antibody against Clostridium difficile toxin A ( Tcd A - C ) was prepared by ELISA . 浠ヨ〃杈綯cd B姘ㄥ熀绔，

本文编号：2015207