LW-AFC对阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆功能的作用及作用机理研究

发布时间：2018-06-21 14:25

  本文选题：LW-AFC + 阿尔茨海默病　； 参考：《中国人民解放军军事医学科学院》2016年博士论文

【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer`s disease,AD)属神经退行性疾病,是当前严重危害人类健康的重大疾病。AD患者脑内典型的病理变化主要包括脑细胞外的β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)斑块即老年斑(senile plague)、细胞内沉积的磷酸化tau蛋白引起的神经原纤维缠结和神经元丢失。AD的临床症状主要为进行性的记忆损害以及其他认知功能的下降,AD患者确诊后的平均存活时间为9年,期间必须有专人进行看护,因此AD对于社会、家庭都是巨大的负担。目前用于AD治疗的药物主要分为乙酰胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-DAspartate,NMDA)受体拮抗剂两大类,分别靶向胆碱能和谷氨酸能突触传递。其中乙酰胆碱酯酶抑制剂主要针对治疗轻中度AD,而NMDA受体拮抗剂主要治疗中重度AD。但是临床数据显示,这些药物对于AD的治疗效果并不理想,仅能够改善部分症状。此外,抗精神病药、抗抑郁药、抗惊厥药、免疫疗法、β-分泌酶/γ-分泌酶抑制剂、α-分泌酶激动剂、tau蛋白聚集/磷酸化抑制剂、金属离子螯合剂和维生素也用于改善AD患者的认知功能和生活质量,但治疗效果依旧不理想。因此,目前为止,仍然没有能够有效预防或治疗AD的方法。上世纪90年代,我室与天然药物化学研究室及沈阳药科大学天然药物化学教研室密切合作,对中医滋补肾阴的经典代表名方六味地黄汤的药理作用、作用机理及药效物质基础进行了系统研究。研究表明,六味地黄汤对快速老化模型小鼠SAMP8等多种模型动物的学习记忆能力低下具有明显改善作用。LW-AFC是从六味地黄汤中分离获得的由活性成分群构成的中药新药,主要含苷类(LWD-b)、多糖(LWB-B)和寡糖(CA-30)三个主要药效组分,具有药效稳定、质量可控、制剂先进、服用方便等优点。该药已获临床批件,申报的第一个适应症为更年期综合征,目前正在进行II期临床试验。本研究以快速老化小鼠SAMP8和家族型AD(familial Alzheimer`s disease,FAD)模型小鼠Pr P-h AβPPswe/PS1ΔE9(APP/PS1)转基因小鼠作为模型,研究了LW-AFC对中枢学习记忆能力、病理改变以及生物标志物的作用。以高月龄自然衰老小鼠SAMR1为衰老模型,观察LW-AFC的抗衰老作用。通过检测HPA轴和HPG轴中的激素水平、脾淋巴细胞的增殖能力、脾淋巴细胞的亚群分型以及血浆中细胞因子的水平,揭示LW-AFC防治AD的作用机制及靶点。第一部分LW-AFC改善中枢学习记忆功能的作用研究1.LW-AFC对SAMP8小鼠中枢学习记忆功能的作用研究选取6月龄雄性SAMP8小鼠,分别灌胃给予多奈哌齐(donepezil)(1mg/kg)、美金刚(memantine)(10mg/kg)、LW-AFC(0.8g/kg、1.6g/kg、3.2g/kg),以SAMR1小鼠作为对照。3个月后进行老化程度评分和自主活动实验,观察LW-AFC对SAMP8小鼠衰老程度的影响;运用跳台实验、穿梭箱实验、Morris水迷宫实验以及新异物体识别实验,观察LW-AFC对SAMP8小鼠中枢学习记忆功能的作用。结果显示,给予1.6g/kg的LW-AFC能够明显降低SAMP8小鼠的老化评分;美金刚和LW-AFC(0.8g/kg、1.6g/kg、3.2g/kg)能够显著提高SAMP8小鼠的自主活动度;1.6g/kg的LW-AFC能够显著提高SAMP8小鼠的被动回避反应能力;美金刚、0.8g/kg和1.6g/kg的LW-AFC能够显著提高SAMP8小鼠空间学习记忆能力和主动回避反应能力;1.6g/kg的LW-AFC能够显著提高SAMP8小鼠的短、长期物体识别记忆能力。该结果表明,LW-AFC能够有效降低SAMP8小鼠的衰老程度,改善其学习记忆能力,且效果要优于阳性药多奈哌齐和美金刚。2.LW-AFC对APP/PS1转基因小鼠中枢学习记忆功能的作用研究选取APP/PS1转基因小鼠作为FAD的模型小鼠,分别灌胃给予多奈哌齐(1mg/kg)、美金刚(10mg/kg)、LW-AFC(1.6g/kg),C57小鼠作为对照。3个月后进行跳台实验、穿梭箱实验、Morris水迷宫实验以及新异物体识别实验,观察LW-AFC对APP/PS1转基因小鼠学习记忆功能的作用;采用免疫荧光染色和尼氏染色,观察LW-AFC对APP/PS1转基因小鼠脑中Aβ的沉积与神经元丢失的作用;采用Alpha ELSA技术检测血液和脑组织中的可溶性Aβ含量,观察LW-AFC对APP/PS1转基因小鼠中Aβ水平的影响。结果显示,APP/PS1转基因小鼠的学习记忆能力明显低于野生型小鼠,给予LW-AFC、美金刚和多奈哌齐能够显著改善APP/PS1转基因小鼠的主动回避反应能力;LW-AFC和美金刚能够显著改善APP/PS1转基因小鼠的空间记忆能力;LW-AFC能够显著改善APP/PS1转基因小鼠的短期物体识别记忆能力和被动回避反应能力;与野生型小鼠相比,APP/PS1转基因小鼠脑中Aβ斑块、海马和血浆中Αβ1-40和Αβ1-42的水平明显升高,海马、CA1区和CA3区中的尼氏小体数量明显降低,给予LW-AFC、美金刚均能够显著减少APP/PS1转基因小鼠脑中的Aβ沉积,降低海马中的Αβ1-42水平,同时LW-AFC还能降低外周血中的Αβ1-42含量。LW-AFC能够明显增加海马中,特别是CA3区中的尼氏小体数量。该结果表明,LW-AFC能够显著改善APP/PS1转基因小鼠的学习记忆能力,并明显减少脑中Aβ斑块和神经元丢失,同时降低脑和血液中的可溶性Aβ水平。3.LW-AFC对自然衰老SAMR1小鼠延缓衰老的作用研究使用12月龄和24月龄的SAMR1小鼠作为衰老小鼠模型,分别灌胃给予褪黑素(melatonin)(1mg/kg)和LW-AFC(1.6g/kg),7月龄的SAMR1小鼠和ICR小鼠作为对照。3个月后进行老化评分、生存期、体重变化、自主活动、空间学习记忆等指标检测。结果显示,12和24月龄SAMR1小鼠的老化评分要明显高于对照组7月龄的SAMR1小鼠和ICR小鼠,给予LW-AFC能够分别在给药30天和45天后,显著降低12和24月龄SAMR1小鼠的老化评分;LW-AFC能够明显提高12月龄SAMR1小鼠的生存率和平均生存天数,以及12和24月龄SAMR1小鼠的平均体重;LW-AFC能够显著改善12和24月龄的SAMR1小鼠的空间记忆能力。表明LW-AFC能够延缓自然衰老SAMR1小鼠的衰老进程。第二部分LW-AFC改善中枢学习记忆功能的作用机理研究1.LW-AFC对SAMP8小鼠NIM网络的调节作用为观察LW-AFC对SAMP8小鼠NIM网络的调节作用,采用3H-Td R掺入法检测SAMP8小鼠脾细胞的增殖能力,流式细胞术检测脾淋巴细胞亚型,液相蛋白芯片技术检测血浆中细胞因子的含量,放射免疫法、化学发光法和酶联免疫吸附法检测HPA轴和HPG轴中激素水平的变化。结果表明,SAMP8小鼠NIM网络的功能明显紊乱,给予1.6g/kg和3.2g/kg的LW-AFC能够显著降低SAMP8小鼠下丘脑中CRH水平;0.8g/kg和1.6g/kg的LW-AFC能够显著降低SAMP8小鼠下丘脑中Gn RH水平、垂体中ACTH、LH和FSH水平;0.8g/kg、1.6g/kg和3.2g/kg的LW-AFC能够显著提高血浆中T水平,而美金刚仅能降低LH的水平。对于SAMP8小鼠的脾淋巴细胞增殖,美金刚和多奈哌齐能够明显提高Con A和LPS刺激的SAMP8小鼠的脾淋巴细胞增殖能力,此外多奈哌齐还能显著提高其脾淋巴细胞的自发增殖能力,而0.8g/kg、1.6g/kg和3.2g/kg的LW-AFC能够明显提高自发和Con A刺激的增殖能力,0.8g/kg和3.2g/kg的LW-AFC能够显著提高LPS刺激的脾淋巴细胞增殖能力。对于SAMP8小鼠的脾淋巴细胞亚型,给予美金刚和LW-AFC(0.8g/kg和1.6g/kg)能够显著提高CD3+CD4+T细胞的表达量,多奈哌齐和LW-AFC(0.8g/kg、1.6g/kg和3.2g/kg)能够显著提高CD8+CD28+T细胞的表达量,美金刚、多奈哌齐和LW-AFC(0.8g/kg、1.6g/kg和3.2g/kg)能够显著提高CD19+B细胞的表达量;美金刚、多奈哌齐和LW-AFC(0.8g/kg和1.6g/kg)能够显著提高CD19+CD80+B细胞的表达量,美金刚和多奈哌齐明显降低了CD3+CD8+T细胞的表达量。多奈哌齐显著提高了SAMP8小鼠血液中CD4+CD25+Foxp3+T细胞的表达量,而LW-AFC(1.6g/kg)则能够明显降低其表达量。此外,美金刚、多奈哌齐和LW-AFC(0.8g/kg和1.6g/kg)能恢复CD4+/CD8+的平衡。对于SAMP8小鼠血液中的细胞因子水平,给予SAMP8小鼠美金刚,能够显著降低其血液中IL-23、TNF-β和eotaxin的水平,多奈哌齐仅能够降低IL-23的水平,LW-AFC(0.8、1.6和3.2 g/kg)则能够明显降低IL-1β、IL-23、GM-CSF、IFN-γ、eotaxin、TNF-α、TNF-β的水平,升高MCP-1的分泌水平,而0.8g/kg和1.6g/kg的LW-AFC能够显著降低IL-2、IL-6和RANTES的水平,1.6g/kg的LW-AFC还能够明显提高IL-5的水平。这些结果提示,LW-AFC能够有效恢复或改善SAMP8小鼠HPA轴和HPG轴平衡,并通过增强淋巴细胞增殖能力、恢复失衡的淋巴细胞亚型、调控异常分泌的细胞因子等途径,调节或改善免疫功能,进而对SAMP8小鼠处于平衡失调、功能紊乱状态的NIM网络发挥调节作用,改善或恢复其平衡状态。2.LW-AFC对APP/PS1转基因小鼠NIM网络的调节作用为观察LW-AFC对APP/PS1转基因小鼠NIM网络的调节作用,采用放射免疫法、化学发光法和酶联免疫吸附法检测APP/PS1转基因小鼠HPA轴和HPG轴的变化;液相蛋白芯片技术检测血浆中细胞因子的含量。结果表明,APP/PS1转基因小鼠的NIM网络平衡紊乱,给予美金刚和LW-AFC能够显著降低APP/PS1转基因小鼠的垂体中的ACTH水平;LW-AFC能够明显降低下丘脑中的Gn RH、垂体中的FSH和LH的水平,美金刚则能够显著降低FSH和LH的水平。美金刚、多奈哌齐和LW-AFC都能够显著提高APP/PS1转基因小鼠脾细胞上清液中CD8+CD28+T细胞的表达量,美金刚和LW-AFC则能够明显降低CD4+CD25+Foxp3+T细胞的表达量。美金刚能够显著降低APP/PS1转基因小鼠血液中IL-1β、IL-6、IL-23、GM-CSF和TNF-β的水平,多奈哌齐仅能降低IL-1β的水平,LW-AFC则能够显著降低IL-1β、IL-2、IL-6、IL-23、GM-CSF、TNF-α、TNF-β和eotaxin的分泌水平,同时还能够明显提高IL-4和G-CSF的水平。该结果表明,LW-AFC能够调节或改善APP/PS1转基因小鼠NIM网络的功能紊乱。3.LW-AFC对自然衰老SAMR1小鼠NIM网络的调节作用为观察LW-AFC对衰老动物模型NIM网络中“免疫衰老”的作用,采用3H-Td R掺入法检测高月龄SAMR1小鼠脾细胞的增殖能力;流式细胞术检测脾淋巴细胞亚型;液相蛋白芯片技术检测血浆中细胞因子的含量。结果表明,12和24月龄的SAMR1小鼠都具有一定程度的免疫功能低下和慢性炎症。给予褪黑素和LW-AFC能够显著提高12月龄SAMR1小鼠脾细胞的自发增殖能力,同时褪黑素和LWAFC还能够提高12和24月龄SAMR1小鼠Con A和LPS刺激的脾细胞增殖能力。对于脾淋巴细胞亚型,褪黑素能够明显恢复12和24月龄的SAMR1小鼠CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞和CD19+B细胞的表达量以及12月龄SAMR1小鼠的CD4+/CD8+的比值和24月龄SAMR1小鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞的表达量;LW-AFC能显著恢复12和24月龄的SAMR1小鼠CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞和CD19+B细胞的表达量,同时还能改善24月龄的SAMR1小鼠CD3+T细胞、CD4+/CD8+和CD4+CD25+Foxp3+T细胞的表达紊乱。褪黑素能够明显改善12月龄SAMR1小鼠外周血中9个促炎因子(eotaxin、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17、RANTES、TNF-α)以及全部抗炎因子(G-CSF、IL-4、IL-5、IL-10)的水平异常,也能改善24月龄SAMR1小鼠外周血中8个促炎因子(GMCSF、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-17、RANTES、TNF-α、TNF-β)和1个抗炎因子(IL-4)的水平异常;给予LW-AFC能够显著改善12月龄SAMR1小鼠外周血中11个促炎因子(eotaxin、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17、RANTES、TNF-α、IL-23、TNF-β)以及全部抗炎因子(G-CSF、IL-4、IL-5、IL-10)的水平异常,也能够改善24月龄SAMR1小鼠外周血中12个促炎因子(eotaxin、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17、MCP-1、RANTES、TNF-α、IL-23、TNF-β)的水平异常,但对抗炎因子无效。该结果提示,LW-AFC能够通过调节高月龄SAMR1小鼠的免疫功能低下,降低慢性炎症,延缓SAMR1小鼠的免疫衰老。4.LW-AFC对NIM网络的作用靶点分析为深入研究LW-AFC改善SAMP8小鼠和APP/PS1转基因小鼠认知功能的作用靶点。采用Pearson相关性分析的方法,对SAMP8小鼠和APP/PS1转基因小鼠NIM网络中激素、细胞因子与其认知功能相关性进行了研究与分析,发现NIM网络与认知功能具有相关性;采用多重线性回归分析,发现在神经内分泌方面,HPG轴中的LH、T和Gn RH与SAMP8小鼠的认知功能相关;HPG轴的T和LH,HPA轴中的ACTH与APP/PS1转基因小鼠的认知功能相关。在细胞因子方面,Th1细胞分泌的细胞因子(GM-CSF、IFN-γ、IL-2、TNF-α),IL-23,趋化因子(eotaxin、RANTES)与SAMP8小鼠的认知功能相关;Th2细胞分泌的细胞因子(GM-CSF、IL-6),趋化因子(eotaxin)与APP/PS1转基因小鼠的认知功能相关。对于SAMP8小鼠,LW-AFC可调节与认知功能紧密相关的分子为:Gn RH、LH、T、GM-CSF、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-23、eotaxin、RANTES。对于APP/PS1转基因小鼠,LWAFC可调节与认知功能紧密相关的分子为:ACTH、LH、GM-CSF、IL-6、eotaxin。提示这些分子有可能是LW-AFC防治AD的潜在作用靶标,对不同的AD动物模型,LW-AFC能够通过作用于不同的靶点,改善不同原因所导致的认知功能损伤。通过以上研究,本研究主要得出以下结论:1.LW-AFC能够改善SAMP8小鼠和APP/PS1转基因小鼠的主动、被动回避反应能力、空间学习记忆能力和物体识别记忆能力;此外,能降低自然衰老SAMR1小鼠的老化度评分、延长生存期,表明长期口服给予LW-AFC对AD模型动物学习记忆功能具有明显改善作用,并具有明显抗衰老作用。2.LW-AFC能够明显改善SAMP8小鼠和APP/PS1转基因小鼠所表现的HPA轴和HPG轴平衡失调,纠正或改善淋巴细胞亚型分布及细胞因子分泌异常;此外,改善和调节自然衰老SAMR1小鼠免疫功能,表明长期口服给予LW-AFC对AD模型动物神经内分泌和免疫功能紊乱均具有明显调节作用。3.LW-AFC能够改善多种模型动物学习记忆功能、改善神经内分泌及免疫功能。对于SAMP8小鼠,LW-AFC主要通过作用于Gn RH、LH、T、GMCSF、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-23、eotaxin和RANTES改善认知;对于APP/PS1转基因小鼠,LW-AFC则主要作用于ACTH、LH、GM-CSF、IL-6、eotaxin。提示LW-AFC对改善AD模型小鼠中枢学习记忆功能的作用是通过调节NIM网络平衡而发挥的。4.LW-AFC与已有防治AD药物不同,调节、恢复和维护NIM网络的平衡是LW-AFC的作用特点,也是其基本作用机理,特色明显,具有防治AD潜在的临床价值和良好的开发前景。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16;R-332
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本文编号：2049024