金黄色葡萄球菌SasA蛋白免疫保护性的研究

发布时间：2018-07-04 15:24

本文选题：金黄色葡萄球菌 + SasA　；参考：《中国人民解放军军事医学科学院》2016年博士论文

【摘要】：金黄色葡萄球菌(以下简称金葡菌)是一种重要的条件致病菌,能够导致多种疾病,包括皮肤和软组织的轻微感染、肺炎、菌血症、心内膜炎、中毒性休克综合征和骨髓炎等。多重耐药金葡菌株(如甲氧西林耐药金葡菌,methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的出现和流行,使得依赖抗生素的治疗手段不再可靠,进行金葡菌疫苗和抗体的研究迫在眉睫。金葡菌的多种致病因子已被作为潜在的免疫靶点进行研究,然而目前还没有一个金葡菌的疫苗和抗体显示对人体有效,提示我们有必要开展针对金葡菌其他抗原的研究。金葡菌Sas A(S.aureus surface protein A)蛋白是金葡菌的一个表面蛋白,属于SRRP(serine-rich repeat proteins)蛋白家族,之前的研究表明Sas A蛋白的主要功能是粘附素。在小鼠金葡菌感染模型中,我们发现Sas A蛋白的主动免疫和Sas A单抗的被动免疫具有保护性,结合分子流行病学的调查和生物信息学的分析,我们认为Sas A是抵御金葡菌感染的一个新的候选免疫靶点。生物信息学和分子流行病学的调查表明Sas A基因在临床菌株中分布广泛,Sas A蛋白含有一个保守的结构域。我们对36个全基因组测序公开的金葡菌株进行了生物信息学的分析,这些菌株来源广泛,具有一定的代表性,经检验所有的菌株都携带Sas A基因。另外,我们从306医院分离得到了42株临床金葡菌,对这些菌株进行基因分型后证实85%的ST239(中国MRSA流行株)都携带Sas A基因。Sas A蛋白是一个具有2,271个氨基酸的表面蛋白,结构域预测分析(Motif Scan)显示Sas A蛋白包含两个丝氨酸富集重复的结构域(serine-rich repeatregions,SRR)和一个非重复序列结构域(non-repeat region,NRR),SRR1、NRR和SRR2的氨基酸序列分别为48-229aa、230-751aa和752-2213aa。序列同源分析表明SRR1、NRR和SRR2在不同菌株间的同源性分别为75.8%、90.4%和49.3%,NRR是Sas A最为保守的结构域。此外,我们采集了金葡菌感染病人的血清和健康人的血清,ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)检测显示金葡菌感染病人血清中Sas A的抗体水平显著高于健康人,表明在感染人体时金葡菌会表达Sas A,并且能够刺激人体产生针对Sas A的抗体反应。Sas A蛋白的主动免疫具有保护性。我们制备了Sas A蛋白的不同重组表达片段:SRR1(48-229aa)、NRR(230-751aa)、NRR1(230-540aa)和NRR2(490-751aa)。体内实验显示SRR1、NRR和NRR1具有良好的免疫原性,能够在小鼠体内诱导产生较高水平的抗体反应。在小鼠金葡菌腹腔感染模型中,SRR1和NRR1的主动免疫能够保护小鼠对于金葡菌USA300(北美流行株)的致死攻毒,而NRR和NRR2片段不具有免疫保护性。另外,我们制备了针对SRR1-NRR1(48-540aa)的鼠多抗,被动免疫后同样在小鼠金葡菌感染模型中具有保护性,提示我们体液免疫在Sas A蛋白免疫保护性中起到了重要作用。抗Sas A单抗的被动免疫具有保护性。除了疫苗的主动免疫,抗体的被动免疫也是抵御金葡菌感染的重要手段。单抗具有高同质性、高稳定性和低免疫原性的特点,通过杂交瘤技术和ELISA筛选,我们制备了针对Sas A不同表位并具有高效价的Sas A单抗。对这些单抗进行体外活性和体内保护性评价后,我们对单抗2H7进行了进一步的研究。2H7单抗识别Sas A的保守结构域并能结合金葡菌,具有增强中性粒细胞调理吞噬杀伤的活性。通过5’RACE、反转录和巢式PCR我们扩增得到了2H7的抗体轻重链基因,进而分析了抗体可变区的序列。ELISA实验显示单抗2H7不能结合SRR1,而对NRR1和NRR具有高亲和力,表明2H7识别的是Sas A的保守结构域,并且2H7能够直接识别金葡菌。之前的研究表明Sas A具有结合人血小板的功能,在金葡菌心内膜炎感染中起到重要作用。我们首先通过流式实验证实了Sas A的NRR结构域而不是SRR1区能够结合小鼠的血小板。然而,单抗2H7并不能抑制Sas A与血小板的结合,提示我们2H7在心内膜炎感染模型中可能并不具有保护性。中性粒细胞是宿主对抗病原体感染的重要防线,抗体作为调理素能够促进中性粒细胞对病原体的吞噬杀伤。在体外鼠全血杀伤模型和人中性粒细胞HL-60细胞系模型中,2H7都体现出了调理吞噬杀伤金葡菌的活性。2H7单抗在小鼠金葡菌感染模型中具有保护性。鉴于长期进行血液透析和腹膜透析的病人容易遭受MRSA的感染,我们在小鼠金葡菌菌血症模型和腹腔感染模型中评价了2H7的保护性,并且选择USA300和ST239作为攻毒菌株,二者分别是北美地区和亚洲地区的MRSA流行株。在菌血症模型中,攻毒前24 h被动免疫2H7单抗,能够保护小鼠对于USA300和ST239的致死攻毒。并且2H7也显示出治疗性应用的潜力,致死攻毒1 h后被动免疫2H7也能够提高小鼠的生存率。在腹腔感染模型中,2H7同样能够保护小鼠对于USA300和ST239的致死攻毒。考虑到临床上的金葡菌感染病人并不会接触高剂量的金葡菌,我们在菌血症模型和腹腔感染模型中也进行了亚致死攻毒的保护性实验,结果显示2H7能够减少肾脏的金葡菌菌落数,并且能够减少金葡菌腹腔脓肿的形成。综上所述,Sas A基因在金葡菌中分布广泛,Sas A蛋白含有一个保守的结构域,并且Sas A蛋白的主动免疫和Sas A单抗的被动免疫在小鼠金葡菌感染模型中具有保护性。以上结果证实Sas A蛋白是抵御耐药金葡菌感染的一个新的候选免疫靶点。
[Abstract]:Staphylococcus aureus ( S . aureus surface protein A ) is a new candidate immune target for Staphylococcus aureus . In vivo experiments show that SRR1 , NRR and NRR1 have a protective effect on Sas A . In addition , we have prepared different recombinant expression fragments of Sas A . In addition , we have prepared different recombinant expression fragments of Sas A . In addition , we have prepared different recombinant expression fragments of Sas A . The results showed that 2H7 could protect mice from lethal challenge of USA300 and ST239 . The results showed that 2H7 could reduce the number of Staphylococcus aureus colonies in the kidney , and could decrease the survival rate of mice . In conclusion , the Sas A protein contained a conserved domain , and Sas A protein had a protective effect in the model of Staphylococcus aureus infection .
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.11

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