抗Siglec-9抗体Fab段抑制脂多糖诱导的炎性反应的体外研究

发布时间：2018-07-14 18:31

【摘要】：Siglec-9属于免疫球蛋白超家族的成员,归属于CD33相关的Siglec,通过识别含有唾液酸的糖链结构,在细胞增殖、活化以及凋亡和自噬方面发挥重要作用,同时参与调控机体的固有免疫和适应性免疫。Siglec-9主要表达于免疫细胞,如中性粒细胞和单核细胞,在淋巴细胞和树突状细胞上也可表达。脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征,细菌内毒素刺激巨噬细胞产生大量的炎性因子,引起机体的抗炎因子和促炎因子失衡,严重时导致脓毒性休克和多器官功能衰竭。本课题主要是通过基因工程技术,制备、表达抗Siglec-9Fab段,并对其进行生物特性鉴定,通过体外活性实验进一步探讨该抗体在炎症方面发挥的作用。研究方法:1.制备抗Siglec-9抗体Fab利用前期筛选得到的阳性噬菌体,通过PCR技术扩增抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH),经测序得到核酸和氨基酸序列并与数据库比对。根据核酸序列设计引物,通过重叠延伸PCR技术将抗体轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH1)分别与轻链可变区和重链可变区连接,获得重组轻链(L)和重链(Fd)。经过限制性核酸内切酶酶切,L和Fd与表达载体pETDUET-1连接,构建重组质粒pETDUET-1-Fab。将重组质粒pETDUET-1-Fab转入大肠杆菌BL21,加入IPTG诱导表达,经蛋白纯化系统得到抗Siglec-9抗体Fab段。2.抗Siglc-9抗体Fab段与抗原结合能力的鉴定和抗体亲和力分析采用SDS-PAGE和Western blot鉴定抗Siglec-9抗体Fab段,ELISA、流式细胞仪和Biacore X100分别检测抗Siglec-9抗体Fab与Siglec-9的特异性结合能力和抗体的亲和力。3.抗Siglec-9抗体Fab的体外实验抗Siglec-9抗体Fab作用于THP-1细胞分化的巨噬细胞和人单核外周血单核细胞来源的巨噬细胞,通过Q-PCR和ELISA分别检测炎性细胞因子的表达量,通过Western blot检测TLR4信号通路上蛋白磷酸化水平的变化。研究结果:1.通过PCR技术成功扩增抗体可变区,经测序验证未产生无功能基因或发生基因突变,利用重叠延伸PCR技术连接抗体的可变区和恒定区,得到重组重链Fd和轻链L,重组原核系统表达质粒pETDUET-1-Fab成功构建。转入大肠杆菌BL21表达,经蛋白纯化系统纯化得到抗Siglec-9抗体Fab。2.SDS-PAGE和Western blot结果显示抗Siglec-9抗体Fab主要表达于上清中,分子量约27KD。ELISA、流式细胞仪结果显示抗Siglec-9抗体Fab特异性结合Siglec-9。Biacore X100检测得亲和常数为6.58×10~(-7)。3.Q-PCR和ELISA显示抗Siglec-9抗体Fab可有效的抑制促炎性细胞因子和促进抑炎性细胞因子的表达量,Western blot显示抗Siglec-9抗体Fab可抑制TLR4信号通路上蛋白的磷酸化水平。研究结论:本实验研究成功制备抗Siglec-9抗体Fab段,该抗体特异性结合Siglec-9,并具有较高的亲和力,体外实验研究表明可明显抑制促炎性细胞因子IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-6和促进抗炎性细胞因子IL-10的mRNA水平和蛋白水平表达量,并且可抑制TLR4信号通路上蛋白的磷酸化,发挥抗炎保护作用。本研究通过基因工程得到的单克隆抗体,可能成为新的预防和治疗炎性相关疾病的方法。
[Abstract]:The recombinant plasmid pETDUET - 1 - Fab was cloned into E . coli BL21 . The recombinant plasmid pETDUET - 1 - Fab was amplified by PCR . TNF - 伪 , IL - 1尾 , IL - 6 and pro - inflammatory cytokines IL - 10 mRNA levels and protein level expression levels , and can inhibit the phosphorylation of protein on the signaling pathway , and exert anti - inflammatory protective effect . The monoclonal antibody obtained by genetic engineering may be a new method to prevent and treat inflammatory related diseases .
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392

【参考文献】