半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白1的基因克隆真核表达及细胞定位

发布时间：2018-08-24 13:14

【摘要】：目的构建带FLAG标签的半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白1(CRP1)的真核表达载体,明确该融合蛋白在人胚肾293T细胞、肝癌HepG2细胞和乳腺癌ZR75-1细胞中的表达及定位情况。方法采用PCR技术从乳腺cDNA文库中扩增出人CRP1基因,并将其插入到pCMV-Tag2B表达载体中;将重组质粒转染人胚肾293T细胞、肝癌HepG2细胞、乳腺癌ZR75-1细胞,Western blot法检测转染细胞的表达情况;荧光显微镜观察pCMV-FLAG-CRP1在人胚肾293T细胞、肝癌HepG2细胞、乳腺癌ZR75-1细胞中的定位。结果双酶切和测序鉴定表明,pCMV-FLAG-CRP1真核表达质粒构建成功;Western blot法检测pCMV-FLAG-CRP1转染293T细胞、肝癌HepG2细胞、乳腺癌ZR75-1细胞后成功表达;荧光显微镜下观察,在293T、HepG2、ZR75-1细胞中,CRP1在细胞质和细胞核中均有分布,且胞质信号强于胞核。结论成功构建pCMV-FLAG-CRP1真核表达载体,CRP1可在不同细胞中的胞质和胞核表达。
[Abstract]:Objective to construct the eukaryotic expression vector of cysteine and glycine enriched protein 1 (CRP1) labeled with FLAG, and to determine the expression and localization of the fusion protein in 293T cells of human embryonic kidney, HepG2 cells of liver cancer and ZR75-1 cells of breast cancer. Methods Human CRP1 gene was amplified by PCR from mammary gland cDNA library and inserted into pCMV-Tag2B expression vector. The recombinant plasmid was transfected into 293T cells of human embryonic kidney, HepG2 cells of liver cancer and ZR75-1 cells of breast cancer. The localization of pCMV-FLAG-CRP1 in 293T cells of human embryonic kidney, HepG2 cells of liver cancer and ZR75-1 cells of breast cancer was observed by fluorescence microscope. Results double enzyme digestion and sequencing showed that pCMV-FLAG-CRP1 eukaryotic expression plasmid was successfully constructed to detect the expression of pCMV-FLAG-CRP1 in 293T cells, hepatocarcinoma HepG2 cells and breast cancer ZR75-1 cells by Western blot assay. CRP1 was distributed in the cytoplasm and nucleus of 293T HepG2G 2 + ZR75-1 cells, and the cytoplasmic signal was stronger than that in the nucleus. Conclusion pCMV-FLAG-CRP1 eukaryotic expression vector can be successfully constructed to express cytoplasm and nucleus in different cells.
【作者单位】： 军事医学科学院生物工程研究所;解放军总医院第一附属医院肿瘤一科;解放军总医院内分泌科;
【基金】：国家自然科学基金(30872939,31100604,81101065)
【分类号】：R346

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本文编号：2200928