微小RNA-132在卵巢颗粒细胞中的功能研究

发布时间：2018-09-04 09:38

【摘要】：第一章微小RNA-132通过抑制Nurrl促进卵巢颗粒细胞雌激素的合成目的：研究卵巢颗粒细胞中卵泡刺激素(FSH)通路对微小RNA-132 (miR-132)的调控以及miR-132影响颗粒细胞雌激素合成的分子机制。方法：体外分离培养21天ICR小鼠的原代卵巢颗粒细胞(mGC),经8-Br-cAMP处理24 h后检测mGC中miR-132的表达变化。mGC分别转染miR-132模拟物(mimics)、Nurrl小干扰RNA、Flag-Nurrl质粒或对应阴性对照48 h后,免疫化学发光法检测细胞培养上清雌二醇(E2)和孕酮的浓度,real time PCR检测Cyp19a1、Cyp11a1和Nurrl的mRNA水平改变；Western blot检测miR-132对Nurrl蛋白表达的影响。构建含有Nurrl基因3’不翻译端(3'-UTR)序列的荧光素酶报告基因质粒,验证miR-132对Nurrl基因表达的转录后抑制作用。结果：体外培养的mGC经8-Br-cAMP处理24 h后,miR-132的表达持续升高,并于12h达到峰值(4.8倍,P0.05)。高表达miR-132的mGC E2分泌水平升高70%以上(P0.01),而孕酮分泌无明显改变。Real time PCR结果显示miR-132促进雌激素合成限速酶-芳香化酶基因Cypl9al的表达(2.8倍,P0.01),而孕激素合成关键酶基因Cypllal无明显改变。mGC高表达miR-132后Nurr1蛋白水平明显抑制,但Nurrl mRNA的水平无显著改变；miR-132可显著抑制pmirGLO-luc-Nurrl 3'-UTR-WT质粒荧光素酶活性(P0.01),而对其靶向序列突变后的pmirGLO-luc-Nurrl 3'-UTR-MU质粒无显著影响。以上研究表明miR-132可通过转录后抑制孤儿核受体Nurr1的表达,减弱Nurr1对Cypl9al基因PII启动子的抑制。mGC转染siNurr1干扰内源性Nurr1表达后,miR-132促进E2合成的作用被明显削弱；mGC中高表达Flag-Nurr1后,外源性Nurr1可显著抵消miR-132促进E2合成的效应。结论：miR-132通过靶向Nurr1 mRNA的3'-UTR,转录后抑制Nurr1的蛋白表达,间接上调Cyp19a1,促进卵巢颗粒细胞的E2合成。第二章微小RNA-132靶向抑制Foxal诱导卵巢颗粒细胞凋亡目的： 研究miR-132通过直接靶向抑制小鼠卵巢中Foxal基因的蛋白表达,进而影响雌激素受体(ER)通路,促进颗粒细胞凋亡的分子机制。方法：在原代培养的mGC瞬时转染miR-132 mimics高表达外源性miR-132后,分别通过流式细胞术Annexin V和Cell Death Detection ELISA检测颗粒细胞凋亡程度。Western blot检测miR-132高表达对mGC中ERa和ERβ蛋白表达的影响。免疫组织化学检测Foxal在小鼠卵巢卵泡中的表达和分布,以及检测PMSG处理后卵巢Foxal表达的变化。荧光素酶报告基因实验和Western blot验证Foxal为miR-132直接的靶基因。利用Foxal特异性的小干扰RNA (siRNA)序列基因沉默内源性Foxal,研究其通过下调ERa参与mGC凋亡的机制。此外通过细胞免疫荧光实验观察miR-132对ERa蛋白核定位的影响。结果：流式细胞术Annexin V和Cell Death Detection ELISA检测结果均显示转染miR-132 mimics后促进mGC凋亡(P0.05),并呈现剂量相关性。mGC中高表达miR-132后可以明显下调ERa蛋白的表达,而对ERβ的蛋白则无明显作用。小鼠卵巢中Foxal蛋白主要表达于各级卵泡的颗粒细胞中；出生后21天小鼠给予PMSG (5 IU/只)刺激后,卵巢生长卵泡的颗粒细胞中Foxal的免疫组织化学信号明显减弱。与对照组相比,miR-132可显著抑制pmirGLO-luc-Foxa1 3'-UTR荧光素酶活性达45%(P0.05),并且抑制Foxal蛋白表达的表达水平,证明miR-132直接转录后抑制Foxal基因的表达。特异性siFoxal沉默内源性Foxal基因表达后,Western blot结果显示凋亡细胞中ERa表达相应减少,mGC凋亡亦明显增加(P0.001)。细胞免疫荧光实验显示外源性高表达miR-132还可以促进ERa蛋白由细胞核内向mGC细胞浆中分散。结论：miR-132通过直接靶向抑制mGC中Foxa1的基因表达,下调ERa水平,并促进ERa核输出,诱导mGC凋亡。
[Abstract]:Chapter 1 MicroRNA-132 promotes estrogen synthesis in ovarian granulosa cells by inhibiting Nurrl: To investigate the regulation of follicle stimulating hormone (FSH) pathway on microRNA-132 (microRNA-132) in ovarian granulosa cells and the molecular mechanism of microRNA-132 affecting estrogen synthesis in granulosa cells. Methods: Primary ovaries of 21-day ICR mice were isolated and cultured in vitro. Mimics, Nurrl small interfering RNA, Flag-Nurrl plasmid or corresponding negative control were transfected with mGC for 48 hours. Immunochemiluminescence assay was used to detect the concentration of estradiol (E2) and progesterone in the supernatant of cell culture. Real-time PCR was used to detect Cyp19a1, Cyp11a1 and Nurrl. Western blot was used to detect the effect of microRNAs-132 on the expression of Nurrl protein. Luciferase reporter gene plasmid containing 3'-UTR sequence of Nurrl gene was constructed to verify the inhibitory effect of microRNAs-132 on the transcriptional expression of Nurrl gene. The secretion level of mGC E2 with high expression of miR-132 increased by more than 70% (P 0.01), while progesterone secretion did not change significantly. Real-time PCR results showed that microwave-132 promoted the expression of estrogen synthesis rate-limiting enzyme-aromatase gene Cypl9al (2.8 times, P 0.01). Mi-132 significantly inhibited the activity of luciferase in pmirGLO-luc-Nurrl 3'-UTR-WT plasmid (P 0.01), but had no significant effect on the mutant pmirGLO-luc-Nurrl 3'-UTR-MU plasmid. After transfection of siNurr1 into mGC, the effect of microRNAs-132 on E2 synthesis was significantly weakened. After high expression of Flag-Nurr1 in mGC, exogenous Nurr1 significantly counteracted the effect of microRNAs-132 on E2 synthesis. Nurr1 mRNA 3'-UTR, after transcription, inhibits the expression of Nurr1 protein, indirectly up-regulates Cyp19a1 and promotes E2 synthesis in ovarian granulosa cells. Chapter 2 MicroRNA-132 targeting inhibits Foxal-induced apoptosis of ovarian granulosa cells. Objective: To investigate the effect of microRNA-132 on estrogen receptor (E) by directly targeting the expression of Foxal gene in mouse ovary. Methods: After primary cultured mGC transfected with high expression of exogenous miR-132 mimics, the apoptosis of granulosa cells was detected by flow cytometry Annexin V and Cell Death Detection ELISA respectively. Western blot was used to detect the expression of ERa and ER beta proteins in mGC. Effects. Immunohistochemistry was used to detect Foxal expression and distribution in mouse ovarian follicles and the changes of Foxal expression after PMSG treatment. Luciferase reporter gene assay and Western blot confirmed that Foxal was a direct target gene for microarray-132. Foxal-specific small interfering RNA (siRNA) sequence gene was used to silence endogenous Foxal. Results: The results of flow cytometry, Annexin V and Cell Death Detection ELISA showed that the transfection of Mi-132 mimics promoted the apoptosis of mGC (P 0.05), and showed a dose-dependent relationship. Mi-132 was overexpressed in mGC. Foxal protein was mainly expressed in granulosa cells of all levels of follicles. Immunohistochemical signals of Foxal in granulosa cells of ovarian follicles of 21 days postnatal mice stimulated by PMSG (5 IU / mouse) were significantly weakened. Mi-132 significantly inhibited the activity of pmirGLO-luc-Foxa1 3'-UTR luciferase up to 45% (P Cell immunofluorescence assay showed that exogenous high expression of miR-132 could also promote the dispersion of ERa protein from the nucleus to the cytoplasm of mGC. Conclusion: Mi-132 could inhibit the expression of Foxa1 gene in mGC by direct targeting, down-regulate the level of ERa, and promote the output of ERa nucleus, and induce apoptosis of mGC.
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R321

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本文编号：2221702