Cyr61调控脂肪细胞分化的作用及其机制研究

发布时间：2018-09-07 14:45

【摘要】：目的:Cyr61(也称为CCN1或富含半胱氨酸蛋白61)是一种细胞外信号转导分子,是CNN蛋白家族中的一员,该蛋白由4个不同结构域构成,这些结构域在不同的微环境下表现出不同的生物学功能,Cyr61蛋白在细胞分化、血管生成、细胞粘附、细胞凋亡等生物学进程中起重要调控作用。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种来源于中胚层,具有多向分化潜能的成体干细胞,在间充质干细胞向脂肪细胞分化和成骨细胞分化两个进程中存在着此消彼长的生物学现象。有研究表明,Cyr61在调控成骨细胞分化的过程中起到了非常重要的作用,而Cyr61在脂肪细胞分化过程中的作用及机制却鲜有报道。本研究以Cyr61为对象探讨其对脂肪细胞分化的调节作用,并阐明其调节机制。方法:1、间充质细胞系C3H10T1/2转染Cyr61过表达质粒和敲减Cyr61的siRNA(Cyr61 siRNA),当细胞生长至完全融合时进行成脂诱导培养基处理,利用油红O染色、qRT-PCR和Western Blotting等技术探究Cyr61对C3H10T1/2细胞成脂分化的影响;2、转染Cyr61 siRNA到间充质细胞C3H10T1/2,18 h后更换为含有Wnt3a蛋白的新鲜DMEM完全培养基,转染48小时后,通过细胞免疫荧光实验检测β-连环蛋白(β-catenin)进入细胞核的情况;提取C3H10T1/2细胞核蛋白运用Western blotting检测细胞核内β-catenin和T细胞因子(T cell factor,TCF)-4蛋白水平。由此来确定Cyr61对经典Wnt通路的作用;3、转染Cyr61 siRNA到间充质细胞C3H10T1/2,提取细胞总蛋白。运用Western blotting检测细胞内mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)信号通路活性的标志蛋白雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)和S6K1蛋白(ribosomal protein S6 kinase,polypeptide 1)的磷酸化水平,从而确定Cyr61对mTORC1信号通路的作用;4、C3H10T1/2转染Cyr61 siRNA后,到细胞生长至完全融合时加入mTOR蛋白特异性抑制剂雷帕霉素(Rapamycin,RAP),并进行成脂诱导处理。观察抑制mTORC1信号通路活性是否减弱Cyr61 siRNA对C3H10T1/2细胞成脂分化的影响,探讨Cyr61调节脂肪细胞分化的分子机制。结果:1、转染Cyr61过表达质粒后,C3H10T1/2细胞成脂分化减弱,过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、CCATT增强结合蛋白α(CCAAT enhancer binding proteinα,C/EBPα)、脂肪细胞特异性基因aP2(Adipocyte fatty acid-binding Protein 2)和脂肪酶(Adipsin)的表达均下调。转染Cyr61 siRNA敲减Cyr61水平后,C3H10T1/2细胞成脂分化增强,成脂因子表达水平升高。以上结果表明Cyr61抑制C3H10T1/2细胞向脂肪细胞分化的进程。2、细胞免疫荧光实验结果表明,在C3H10T1/2细胞中Cyr61 siRNA能够抑制β-catenin进入细胞核;Western blotting结果表明核内β-catenin和TCF-4水平下降,表明Cyr61可以激活经典Wnt信号通路。3、Cyr61 siRNA能够提高mTOR蛋白和S6K1蛋白的磷酸化水平,表明Cyr61能够抑制mTORC1信号通路的活性。4、转染Cyr61 siRNA后进行成脂诱导,与对照组比较,雷帕霉素处理后mTOR蛋白和S6K1蛋白的磷酸化水平下降,Cyr61 siRNA促进成脂分化和成脂特异性因子表达的作用因雷帕霉素处理而减弱,表明Cyr61 siRNA通过激活mTORC1通路而促进成脂分化。这些结果提示Cyr61可以通过抑制mTORC1信号通路的活性进而抑制脂肪细胞的分化过程。结论:1、Cyr61抑制C3H10T1/2细胞向脂肪细胞分化;2、Cyr61能够激活Wnt/β-catenin信号通路,同时抑制mTORC1信号通路的活性,进而调控C3H10T1/2细胞向脂肪细胞分化。
[Abstract]:OBJECTIVE: Cyr61 (also known as CCN1 or cysteine-rich protein 61) is an extracellular signal transduction molecule and a member of the CNN protein family. The protein consists of four different domains. These domains display different biological functions in different microenvironments. Cyr61 protein is involved in cell differentiation, angiogenesis, cell adhesion and cell death. Mesenchymal stem cells (MSCs) are mesenchymal stem cells derived from mesoderm and have the potential of multi-directional differentiation. There are two biological phenomena in the process of mesenchymal stem cells differentiating into adipocytes and osteoblasts. Cyr61 plays a very important role in the regulation of osteoblast differentiation, but the role and mechanism of Cyr61 in adipocyte differentiation have rarely been reported. Cyr61 was used as the object of this study to investigate its regulatory effect on adipocyte differentiation and clarify its regulatory mechanism. Methods: 1. Mesenchymal cell line C3H10T1/2 transfected Cyr61 overexpression. Cyr61 siRNA was transfected into C3H10T1/2 mesenchymal cells and transformed into C3H10T1/2 cells containing Wnt3a protein after 18 hours. Fresh DMEM complete medium was transfected for 48 hours, and the entry of beta-catenin into the nucleus was detected by immunofluorescence assay. The nucleoprotein of C3H10T1/2 cells was extracted and the levels of beta-catenin and T cell factor (TCF) -4 in the nucleus were detected by Western blotting. 3. Transfection of Cyr61 siRNA into mesenchymal cells C3H10T1/2 to extract total protein. Western blotting was used to detect the activity of mammalian target of rapamycin complex 1 (mTOR) and S6K1 (ribosomal protein S6 kinase, p The phosphorylation level of olypeptide 1 was determined to determine the role of Cyr61 in the mTORC1 signaling pathway; 4, C3H10T1/2 was transfected with Cyr61 siRNA, and then rapamycin (RAP), a mTOR protein-specific inhibitor, was added to the cell growth to complete fusion, and lipid induction was carried out. Results: 1. After transfection of Cyr61 overexpression plasmid, the adipogenic differentiation of C3H10T1/2 cells was weakened, the peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR gamma) and CCATT enhancer binding protein alpha (CCAAT enhancer bind) were enhanced. The expression of ing protein alpha, C/EBPalpha, adipocyte-specific gene aP2 (Adipocyte fatty acid-binding protein 2) and lipase (Adipsin) were down-regulated. After Cyr61 siRNA knockdown Cyr61, the adipogenic differentiation of C3H10T1/2 cells was enhanced and the expression of adipokines was increased. These results indicated that Cyr61 inhibited C3H10T1/2 cells to adipocyte. Cyr61 siRNA inhibited the entry of beta-catenin into the nucleus of C3H10T1/2 cells. Western blotting showed that the levels of beta-catenin and TCF-4 in the nucleus decreased, suggesting that Cyr61 could activate the classical Wnt signaling pathway. 3. Cyr61 siRNA could increase the phosphorylation levels of mTOR and S6K1 proteins. Cyr61 could inhibit the activity of mTORC1 signaling pathway. 4. Cyr61 siRNA was transfected and induced to adipogenic. Compared with the control group, the phosphorylation level of mTOR protein and S6K1 protein decreased after rapamycin treatment, and the effect of Cyr61 siRNA on adipogenic differentiation and adipogenic specific factor expression was weakened after rapamycin treatment. These results suggest that Cyr61 can inhibit adipocyte differentiation by inhibiting the activity of mTORC1 signaling pathway. Conclusion: 1. Cyr61 inhibits the differentiation of C3H10T1/2 cells into adipocytes; 2. Cyr61 can activate Wnt/beta-catenin signaling pathway and inhibit the activity of mTORC1 signaling pathway. It regulates the differentiation of C3H10T1/2 cells into adipocytes.
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R329.2

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本文编号：2228564