人类胚胎形态学分型与线粒体功能关系的研究

发布时间：2018-10-21 10:51

【摘要】：第一部分人类胚胎形态学分型与线粒体拷贝数、胚胎直径、膜电位及分布关系的研究目的：线粒体作为胚胎发育所需能量的供应源,所提供的能量直接影响着胚胎发育的潜能及胚胎的质量。本研究主要探讨人类不同时期及相同时期不同形态学分型的胚胎与自身线粒体拷贝数、胚胎直径、膜电位及分布的关系及对胚胎发育的影响。方法：选择行IVF-ET不孕患者新鲜周期卵母细胞正常受精后发育较差不适合移植的胚胎152枚,和助孕成功妊娠后自愿丢弃的冷冻胚胎305枚。对于冷冻的胚胎要进行解冻复苏,培养2h后放置倒置显微镜下观察、拍照并进行胚胎形态学的分期、分级评分,把相同时期评分相同的胚胎分成一组。根据胚胎发育时期不同,将所有冷冻胚胎分成D3冷冻胚胎组(卵裂期胚胎n=144)及D5冷冻胚胎组(囊胚n=161)。根据同济生殖中心胚胎培养室的胚胎评分标准,将卵裂期胚胎分为优质胚胎组(n=89)、非优质胚胎组(n=55)和新鲜胚胎组(不能移植的胚胎n=152),将冷冻囊胚分为优质囊胚组(n=101)和非优质囊胚组(n=60)。采用Real-time PCR检测单个胚胎mtDNA拷贝数、荧光探针JC-10检测胚胎线粒体△Ψm,荧光探针Mito Tracker Green对胚胎进行染色观察线粒体的分布。比较不同阶段胚胎和相同阶段不同质量的胚胎与mtDNA拷贝数、胚胎直径、△甲m及线粒体分布的差异。结果：1、D3冷冻胚胎组mtDNA拷贝数明显低于D5冷冻胚胎组(P0.05);新鲜胚胎组mtDNA拷贝数明显低于D3冷冻优质胚胎组和D3冷冻非优质胚胎组(P0.05),而D3冷冻优质胚胎组mtDNA拷贝数与非优质胚胎组差异无统计学差异；D5冷冻优质囊胚组mtDNA拷贝数明显高于非优质囊胚组(P0.05)。2、D3冷冻胚胎组直径明显低于D5冷冻胚胎组(P0.01),D3冷冻优质胚胎组直径与非优质胚胎组差异无统计学意义,D5冷冻优质囊胚组直径明显高于非优质囊胚组(P0.05)。3、D3冷冻胚胎组线粒体△Ψm明显低于D5冷冻胚胎组(P0.05),新鲜胚胎组线粒体△Ψm明显低于D3冷冻优质胚胎组和D3冷冻非优质胚胎组(P0.01,P0.05),D3冷冻优质胚胎组线粒体△Ψm高于非优质胚胎组(P0.05),D5冷冻优质囊胚组线粒体△Ψm明显高于非优质囊胚组(P0.01)。4、D3冷冻优质胚胎组的线粒体均匀分布于每个卵裂球内,且染色均匀：而D3冷冻非优质胚胎组线粒体不均匀的分布在卵裂球内,且卵裂球染色不均匀；新鲜胚胎组的线粒体弥散在胞质内,且呈不均匀分布；D5冷冻优质囊胚组线粒体主要密集在内细胞团核周围较宽的区域,染色较深且均匀,而D5冷冻非优质囊胚组线粒体主要弥散在内细胞团核周围,染色较浅且不均匀。结论：1、随着胚胎的不断发育mtDNA拷贝数是逐渐增高,质量越好胚胎mtDNA拷贝数越高。2、D5冷冻胚胎组胚胎形态学分型越好的胚胎直径越大,mtDNA拷贝数与胚胎直径呈正相关。3、随着胚胎的不断发育mt△ψm是逐渐增高,质量越好的胚胎△Ψm越高。4、线粒体均匀的分布在卵裂球和内细胞团核周围较宽的区域,胚胎有较好的发育潜能。第二部分人类胚胎形态学分型与胚胎内ATP、ROS及Ca2+水平关系的研究目的：ATP是卵母细胞成熟、受精及胚胎发育的能量保证,ROS是胚胎内重要的氧化还原信号分子,Ca2+是胚胎代谢活动中重要的第二信使,三者均是线粒体的产物并存在密切的相互作用,并通过作用于线粒体而参与胚胎内细胞的增殖、分化和凋亡过程。本研究主要探讨人类不同时期及相同时期不同形态学分型的胚胎与胚胎内ATP、ROS和Ca2+水平的关系及对胚胎发育的影响。方法：选择行IVF-ET不孕患者新鲜周期卵母细胞正常受精后发育较差不适合移植的胚胎152枚,和助孕成功妊娠后自愿丢弃的冷冻胚胎305枚。对于冷冻的胚胎要进行解冻复苏,培养2h后放置倒置显微镜下观察、拍照并进行胚胎形态学的分期、分级评分,把相同时期评分相同的胚胎分成一组。根据胚胎发育时期不同,将所有冷冻胚胎分成D3冷冻胚胎组(卵裂期胚胎n=144)及D5冷冻胚胎组(囊胚n=161)。根据同济生殖中心胚胎培养室的胚胎评分标准,将卵裂期胚胎分为优质胚胎组(n=89)、非优质胚胎组(n=55)和新鲜胚胎组(不能移植的胚胎n=152),将冷冻囊胚分为优质囊胚组(n=101)和非优质囊胚组(n=60)。采用荧光素酶法检测单个胚胎ATP水平,活性氧检测试剂盒检测胚胎内ROS的水平,钙离子荧光探针检测胚胎内Ca2+水平,比较不同阶段胚胎和相同阶段不同质量的胚胎与胚胎内ATP、ROS及Ca2+水平的差异。结果：1、D3冷冻胚胎组线粒体ATP明显低于D5冷冻胚胎组(P0.05),新鲜胚胎组线粒体ATP低于D3冷冻优质胚胎组和D3冷冻非优质胚胎组(P0.05),D3冷冻优质胚胎组线粒体ATP高于非优质胚胎组(P0.05),D5冷冻优质囊胚组线粒体ATP明显高于非优质囊胚组(P0.05)。2、D3冷冻胚胎组线粒体ROS明显低于D5冷冻胚胎组(P0.05),新鲜胚胎组线粒体ROS高于D3冷冻优质胚胎组和D3冷冻非优质胚胎组(P0.01,P0.05),D3冻胚优质胚胎组线粒体ROS低于非优质胚胎组(P0.05),D5冻胚优质囊胚组线粒体ROS低于非优质囊胚组(P0.05)。3、D3冷冻胚胎组线粒体Ca2+明显低于D5冷冻胚胎组(P0.05),新鲜胚胎组线粒体Ca2+高十D3冷冻优质胚胎组和D3冷冻非优质胚胎组(P0.01,P0.05),D3冻胚优质胚胎组线粒体Ca2+低于非优质胚胎组(P0.05),D5冻胚优质囊胚组线粒体Ca2+低于非优质胚胎组(P0.05)。结论：1、随着胚胎的发育胚胎内ATP水平逐渐增高,胚胎内ATP水平越高胚胎质量及发育潜能越好。2、胚胎内ROS和Ca2+水平越高,胚胎质量越差,甚至引起胚胎凋亡。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R321

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