【摘要】:登革病毒(Dengue virus,DENV)是登革热、登革出血热和登革休克综合征的病原体,有四种血清型(DENV1-4),其中DENV-2毒力最强。近年来DENV感染呈扩大蔓延之势,发病率不断升高,DENV感染已经成为热带、亚热带地区严重的社会公共卫生问题之一。DENV在分类上属于黄病毒科的黄病毒属,是单股正链RNA病毒。关于它的复制机理,尤其是RNA复制的分子机制尚不清楚。最近一些研究显示,除了病毒蛋白外,宿主蛋白在病毒翻译和复制调控中起着重要作用。迄今为止,仅有少数参与DENV复制周期的宿主蛋白被鉴定出来,其中RNA结合蛋白(RBP)在病毒RNA代谢、修饰以及终止翻译和启始RNA合成中起到重要作用。DENV基因组非编码区5'UTR和3'UTR是宿主RBPs的主要结合区域,在病毒的复制和翻译中起着重要调控作用。本研究以DENV-2为研究对象,利用RNA亲和捕捉法联合质谱技术分别对细胞外和细胞内组装的DENV-2 5'-3'UTR-蛋白复合体进行分离鉴定,并进一步对其中的部分候选蛋白在DENV-2基因组复制过程中的作用进行了研究,为进一步理解DENV-2基因组复制机制提供了有益的理论基础和实验依据。同时,本研究还建立了一步法分离细胞内RNA-蛋白复合物的技术对于分离和阐明宿主RBP在单股正链RNA病毒中的调控作用提供了重要的技术平台。【主要实验方法和研究结果】1.分离与鉴定DENV-2 RNA 5'-3'UTR结合的宿主蛋白首先将DENV-2 5'UTR和3'UTR c DNA克隆到p CI-neo载体中构建p CI-5'-3'UTR质粒;单酶切后以含有T7启动子的5'-3'UTR为底物体外转录生成5'-3'UTR RNA;然后将带生物素标记的寡核苷酸直接添加到5'-3'UTR RNA的3'末端,生成5'-3'UTR-bio RNA;5'-3'UTR-bio RNA与胞浆蛋白孵育后,通过链亲和素偶联的磁珠直接分离胞浆中与5'-3'UTR-bio RNA结合的宿主蛋白。与单独磁珠组相比,5'-3'UTR-bio RNA组的SDS-PAGE结果显示共有9个特异的差异条带;对9个胶条进行质谱鉴定,结果显示共有78个潜在的与5'-3'UTR RNA结合的宿主蛋白;选择PB小体组分LSm1蛋白和DEx D/H蛋白家族成员DDX21,进一步分析了它们在DENV-2复制过程中的作用。为了探究LSm1蛋白在DENV-2复制过程中的作用机制,首先通过RT-q PCR实验检测了DENV-2感染细胞不同时间点LSm1 m RNA水平,结果显示:随着病毒感染时间延长,DENV-2 RNA和LSm1 m RNA的水平均逐渐升高。随后将针对LSm1靶基因的si RNA转染到Hep G2细胞中,使细胞中LSm1低表达,观察对DENV-2 RNA复制的影响,RT-q PCR实验结果显示:LSm1低表达的细胞中DENV-2 RNA水平降低。收获DENV-2感染低表达LSm1细胞的培养上清,通过流式细胞仪测定培养上清中子代DENV-2感染细胞的比例,以此明确细胞中低表达LSm1蛋白对子代DENV-2产出的影响,结果显示:低表达LSm1蛋白的细胞中子代DENV-2颗粒产生减少。为了分析研究DENV-2 RNA与LSm1的相互作用,利用激光共聚焦显微镜观察了LSm1蛋白在DENV-2感染细胞中的分布,结果显示:LSm1蛋白与ds RNA在胞浆中的核周围存在共定位。RNA免疫沉淀试验(RIP)的结果进一步表明LSm1蛋白直接与DENV-2 RNA的3'UTR结合。以上结果提示,在DENV-2感染的细胞中,LSm1蛋白表达升高,并且被募集到DENV-2复制的场所,与病毒3'UTR RNA结合,从而增强DENV-2的RNA复制。为了研究DDX21蛋白在DENV-2复制中的作用机制,首先通过Western blotting检测了DENV感染细胞不同时间点DDX21的蛋白表达水平,结果表明:DDX21蛋白水平在病毒感染后12 h和24 h显著下降,在感染后36 h恢复并高于正常水平。然后观察DDX21蛋白在DENV-2感染前后的细胞内分布情况,分别收获DENV感染和未感染细胞细胞核和细胞质蛋白,Western blotting检测DDX21的蛋白水平,结果显示:DENV-2感染的细胞中,细胞核中的DDX21蛋白水平显著下降,而细胞质中的DDX21蛋白水平略微上升,但无统计学意义。同时用激光共聚焦显微镜检测DDX21蛋白在DENV-2感染和未感染细胞中的分布,结果显示:在DENV-2感染的细胞中,DDX21在细胞核中的染色强度减弱,而DDX21在细胞质中的染色并没有显著变化。随后我们分别在细胞低表达和过表达DDX21,然后感染DENV-2并通过RT-q PCR检测DENV-2 RNA复制的水平,结果显示:DDX21低表达的细胞中DENV-2RNA表达增高,而其在DDX21过表达的细胞中明显降低。为了明确DDX21蛋白在抑制DENV-2复制过程中的机制,我们又通过双荧光素酶活性实验检测了DENV-2感染细胞中IFN-β和IFN报告基因的活性,结果显示:过表达DDX21蛋白的细胞受到DENV-2感染后,IFN-β和干扰素激活反应元件(ISRE)的反应水平显著升高。为了进一步探索DENV-2如何拮抗DDX21的抑制功能,我们将DDX21与DENV-2丝氨酸蛋白酶复合体NS2b/3的真核表达载体共转染细胞后,Western blotting检测DDX21蛋白水平,结果显示:转染DENV-2 NS2b/3的细胞中DDX21的水平明显降低。随后在培养液中加入蛋白酶抑制MG132后,Western blotting检测结果显示,与NS2b/3共转染的细胞中DDX21水平无明显变化。以上研究结果提示,在DENV-2感染的细胞中,定位于细胞核的DDX21蛋白被募集到细胞质中,参与激活IFN等固有免疫应答,从而抑制病毒复制;随后DENV-2 RNA翻译产生的丝氨酸蛋白酶复合物NS2b/3将细胞质中的DDX21降解,从而拮抗了DDX21的抗病毒作用。RIP的实验结果表明DDX21蛋白在上述过程中与DENV-2 RNA的3'UTR有相互作用。2.分离细胞内组装的DENV-2 5'-3'UTR-RBP复合物方法的建立鉴于体外合成RNA组装的RNP可能与细胞内自然状态下形成的不同,为了克服体外分离RBP方法存在的局限,本研究探索建立了分离细胞内组装DENV-25'-3'UTR RNA与宿主蛋白复合物的新方法。首先我们将DENV-2 5'-3'UTR c DNA和生物素样S1序列克隆到RNA转录载体p HH21中,构建p HH21-5'-3'U-S1质粒。然后将上述质粒转染细胞后,在细胞内转录生成5'-3'UTR-S1 RNA,与宿主蛋白结合细胞内组装RNA-RBP复合物。细胞经365 nm UV交联后,通过链亲和素包被的磁珠RNA亲和捕捉法分离细胞内组装的5'-3'UTR-S1-RBP复合物。SDS-PAGE的结果显示有3个特异胶条,质谱分析共有32个可能与5'-3'UTR结合的宿主蛋白。为进一步分析IGF2BP m RNA小体的组分RPS8蛋白在DENV-2复制中的作用,我们首先利用RT-q PCR法检测了DENV-2感染过表达RPS8的细胞中DENV-2 RNA表达水平,结果显示:RPS8过表达的细胞中,DENV-2 RNA水平明显升高。同时收获了DENV-2感染过表达RPS8蛋白的细胞培养上清,培养上清倍比稀释后感染BHK-21细胞后染色,空斑形成实验结果显示:DENV-2感染过表达PRS8的细胞上清中产出更多子代病毒。然后利用RIP实验检测了DENV-2 RNA与RPS8的结合情况,结果显示:RPS8抗体的RIP产物中可以扩增5'UTR和3'UTR。同时,激光共聚焦显微镜的观察结果表明RPS8与ds RNA在胞浆中存在共定位。上述实验结果表明,RPS8与DENV-2 RNA的5'UTR和3'UTR均有结合,它可能作为病毒复制复合物的一部分促进DENV-2在细胞内的复制。【结论】本研究建立的两种RNA亲和捕捉方法均能成功筛选到与DENV-2 5'-3'UTR相互作用的宿主蛋白。我们发现LSm1和RPS8等宿主蛋白均可促进DENV-2复制,LSm1通过3'UTR与DENV-2 RNA结合,RPS8蛋白与DENV-2 RNA 5'UTR和3'UTR均有相互作用。DDX21在感染早期抑制DENV-2的复制,而它可被DENV NS2B/3蛋白酶复合体降解从而有利于病毒的复制。本研究为进一步理解DENV-2基因组复制机制提供了有益的理论基础和实验依据。同时,建立的一步法分离细胞内RNA-蛋白复合物的技术对于分离在单股正链RNA病毒中起到调控作用的宿主RBP提供了新方法。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R373
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 刘静;A Novel Vector for Abundant Expression of Antisense RNA, Triplex forming RNA and Ribozyme in vivo[J];High Technology Letters;2000年04期
2 鲁慧英;Detection of hepatitis C virus RNA sequences in cholangiocarcinomas in Chinese and American patients[J];Chinese Medical Journal;2000年12期
3 梁小兵 ,万国江 ,黄荣贵;Distribution and Variation of Ribonucleic Acid (RNA) and Protein and Its Hydrolysis Products in Lake Sediments[J];Chinese Journal of Geochemistry;2002年02期
4 Verheyden B ,徐其武;口服脊髓灰质炎疫苗核壳和RNA的稳定性[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;2002年01期
5 CMBE译文组;探索小RNA的功能[J];现代临床医学生物工程学杂志;2004年03期
6 沈维干;RNA interference and its current application in mammals[J];Chinese Medical Journal;2004年07期
7 孙娣;汪洋;张丽娟;闫玉清;;一种简捷提取植物总RNA的方法[J];黑龙江医药;2005年06期
8 南海波;;小麦总RNA的提取[J];渤海大学学报(自然科学版);2006年01期
9 王冬来;;RNA干扰的成功与困惑[J];中国生物化学与分子生物学报;2008年06期
10 杨静;;试验性的小RNA药物可能引发失明[J];中国生物化学与分子生物学报;2009年05期
相关会议论文 前10条
1 金由辛;;面向21世纪的RNA研究[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展(下册)[C];1999年
2 ;第四届RNA全国研讨会大会报告日程安排[A];第四届全国RNA进展研讨会论文集[C];2005年
3 ;Function of Transfer RNA Modifications in Plant Development[A];植物分子生物学与现代农业——全国植物生物学研讨会论文摘要集[C];2010年
4 王峰;张秋平;陈金湘;;棉花总RNA的快速提取方法[A];中国棉花学会2011年年会论文汇编[C];2011年
5 关力;陈本iY;iJ云虹;郭培芝;魏重琴;邱苏吾;苗健;;关于动物}D~T中RNAn,定方法的研究[A];中国生理科学会学术会议论文摘要汇编(生物化学)[C];1964年
6 夏海滨;;小RNA在免疫学领域中的应用研究进展[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年
7 ;The stability of hepatitis C virus RNA in various handling and storage conditions[A];中国输血协会第四届输血大会论文集[C];2006年
8 郭德银;;RNA干扰在病毒研究和控制中的应用[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年
9 甘仪梅;杨业华;王学奎;曹燕;杨特武;;棉花总RNA快速提取[A];中国棉花学会2007年年会论文汇编[C];2007年
10 ;Identification and characterization of novel interactive partner proteins for PCBP1 that is a RNA-binding protein[A];中国优生优育协会第四届全国学术论文报告会暨基因科学高峰论坛论文专辑[C];2008年
相关重要报纸文章 前10条
1 记者 冯卫东;研究人员发现可破坏肿瘤抑制基因的小RNA[N];科技日报;2009年
2 记者 储笑抒 通讯员 盛伟;人体微小RNA有望提前发出癌症预警[N];南京日报;2011年
3 泸州医学院副教授、科普作家 周志远;“大头儿子”与环状RNA[N];第一财经日报;2014年
4 麦迪信;小分子RNA可能有大作用[N];医药经济报;2003年
5 董映璧;美发现基因调控可回应“RNA世界”[N];科技日报;2006年
6 张忠霞;特制RNA轻推一下,就能“唤醒”基因[N];新华每日电讯;2007年
7 聂翠蓉;RNA:纵是配角也精彩[N];科技日报;2009年
8 冯卫东;RNA干扰机制首次在人体中获得证实[N];科技日报;2010年
9 冯卫东 王小龙;英在地球早期环境模拟条件下合成类RNA[N];科技日报;2009年
10 记者 常丽君;新技术让研究进入单细胞内RNA的世界[N];科技日报;2011年
相关博士学位论文 前10条
1 王赵玮;昆虫RNA病毒复制及昆虫抗病毒天然免疫机制研究[D];武汉大学;2014年
2 包纯;一类新非编码RNA的发现以及产生和功能的初探[D];华中师范大学;2015年
3 李语丽;基于MeRIP-seq的水稻RNA m6A甲基化修饰的研究[D];中国科学院北京基因组研究所;2015年
4 熊瑜琳;miR-122靶位基因STAT3调控长链非编码 RNA Lethe促进HCV复制的机制研究[D];第三军医大学;2015年
5 范春节;高通量测序鉴定毛竹小RNA及其功能分析[D];中国林业科学研究院;2012年
6 王加强;小鼠着床前胚胎特异ERV相关长非编码RNA的定向筛选及功能研究[D];东北农业大学;2015年
7 王业伟;非编码RNA SPIU的结构和功能研究和p19INK4D在APL发病中的作用[D];上海交通大学;2013年
8 邹艳芬;子痫前期中非编码RNA对滋养细胞功能的调控及机制探索[D];南京医科大学;2015年
9 朱乔;miR-10b在人肝细胞肝癌发生中的作用及其机制的初步探索[D];第四军医大学;2015年
10 蒋俊锋;长链非编码RNA BACE1-AS促进Aβ聚集及其调节BACE1和SERF1a的ceRNA机制研究[D];第二军医大学;2015年
相关硕士学位论文 前10条
1 陆聪儿;条纹斑竹鲨再生肝脏中差异RNA的研究[D];浙江理工大学;2015年
2 张晓辉;小鼠几种长链非编码RNA基因功能的初步研究[D];昆明理工大学;2015年
3 全弘扬;长链非编码RNA在细胞内质网应激反应中的相关作用及机制研究[D];北京协和医学院;2015年
4 胡亮;DDX19A识别PRRSV基因组RNA并激活NLRP3炎症小体[D];中国农业科学院;2015年
5 张帅兵;应用RNA干扰技术对旋毛虫Nudix水解酶基因功能的研究[D];郑州大学;2015年
6 郑芳芳;肺癌RNA-Seq数据中RNA编辑事件的识别算法和系统分析[D];苏州大学;2015年
7 陈瑞东;长链非编码RNA MEG3在胰腺癌发生发展中作用的实验研究[D];苏州大学;2015年
8 刘骏武;线虫和水稻中环状RNA的预测及分析[D];华中农业大学;2015年
9 李猷;利用RNA干扰技术提高番茄抗TMV侵染能力的研究[D];牡丹江师范学院;2015年
10 吴术盛;SVCV感染EPC细胞microRNA表达谱的初步研究[D];华中农业大学;2015年
,
本文编号:
2330079