小分子化合物协助两性霉素B清除白假丝酵母菌生物膜潜在机制的研究

发布时间：2018-11-20 08:00

【摘要】：目的白假丝酵母菌(Candida albicans,原称白色念珠菌)是人人类常见的条件致病菌,在特定条件下能够引起机体体表及深部组织器官的感染。对于人类免疫缺陷病的患者,白假丝酵母菌所致的系统性念珠菌感染会导致高的死亡率。在自然条件下,几乎所有的微生物实际上是附着在物体的表面,形成生物膜结构来维持生存的。生物膜是附着在物体表面由胞外基质及其内的微生物组成。多数慢性感染与微生物形成的生物膜密切相关。生物膜内的致病微生物往往能够躲避药物的作用从而引起机体致命的系统性感染。同理,白假丝酵母菌生物膜使得白假丝酵母菌菌体免受机体免疫系统的攻击,同时抵挡了抗菌药物对菌体的药理作用,使致病菌不断释放进入机体血液循环从而引发感染。大多数抗菌药物通过作用于微生物的特定靶点来将其消灭(例如阿莫西林等大环内酯类抗生素)。但是口前抗真菌药物种类很少,主要有多烯类抗生素(两性霉素B)等抗真菌药物。这些药物通常对机体有很强的毒副作用,而且随着药物滥用导致了耐药菌株频繁产生,临床上控制感染的难度不断增加。因此,研究生物膜与药物耐受的关系,研发新型抗真菌药物,一直是人们关注的热点。通过查阅文献我们发现国外学者有进行化合物及抗生素连用的研究,他们发现将抗菌药物与化合物联用能够提高抗抗菌药物的治疗效果并且能够减少耐药菌株。这为临床治疗提供了新的思路。因此我们课题组前期的研究便是从国家化合物样品库中购入了五万余个小分子化合物,通过大量筛选,已经筛选出了能够提高两性霉素B药效的小分子化合物。进一步,针对前期实验所筛选出来的化合物,我们对其协同两性霉素B的抗真菌作用进行了进一步的验证。并且在验证其协同作用的同时,利用新兴的转录组测序技术,针对实验组与对照组在基因水平的差异,试图探寻加入小分子化合物后在白假丝酵母菌生物膜中表达差异显著基因,以这些基因为突破点,寻找具体协同作用的生物学靶点。材料和方法培养白假丝酵母菌3153A菌株,通过高通量筛选51520个小分子化合物后针对提高抑制率最明显的F0371-0041(3号)、F0760-2126(10号)化合物进行复筛,利用抗生素敏感性检验,活死细胞染色,细胞毒性检测,转录组测序分析及实时荧光定量PCR验证在体外证实化合物系统两性霉素B清除白假丝酵母菌生物膜的能力,在体内利用小鼠构建系统性念珠菌病模型,分组药物作用后进行组织切片染色,观察菌丝数量来验证化合物对于药物的协同作用。利用IlluminaHiSeq 4000转录组测序,我们分别将实验组与对照组送检,将所有生物信息比对,分析筛选表达差异明显的基因。结果1.在抗生素敏感性检验中,3号及10号化合物显著提高了两性霉素B对微生物的抑制率2.将对照组及实验组进行活死细胞染色后在共聚焦显微镜下拍摄观察,可以直观的看到相比于对照组,实验组中的活菌数量明显减少3.针对3号及10号化合物的细胞毒性检测显示其在实验所以浓度下无明显细胞毒性4.转录组测序分析探查出了实验组及对照组间表达差异明显的基因,利用荧光定量PCR验证后得出了较可靠的几个基因5.体内动物实验验证了在系统性念珠菌病小鼠模型中,实验组与对照组菌丝含量的差异结论通过高通量筛选,由国家化合物库购入的51520个化合物中,我们最终筛选确定了 3号及10号小分子化合物,通过一系列的实验,我们验证了相较于对照组,加有小分子化合物的实验组明显提高了两性霉素B对于白假丝酵母菌生物膜的抑制率,为临床用药提供了新的策略。通过转录组测序分析筛选出的基因是首次发现与小分子化合物协同两性霉素B抗真菌作用相关的基因。通过这些基因,我们将某些特定的通路与化合物的协同作用联系起来,为后续进一步研究提供了新的思路和方向。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R378

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本文编号：2344328