人巨噬细胞极化相关长链非编码RNA表达谱筛选及研究

发布时间：2018-12-10 12:56

【摘要】：目的:利用高通量长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)芯片检测不同极化类型人巨噬细胞中lncRNA与mRNA表达谱变化,初步探讨lncRNA核富集转录本1(NEAT1)对巨噬细胞极化的影响。方法:1.磁珠分选法纯化人外周血单核细胞,经体外培养分化为原代人单核细胞来源的巨噬细胞。以20 ng/ml IFN-γ及100 ng/ml LPS刺激巨噬细胞18 h将其诱导成M1型巨噬细胞模型,以20 ng/ml IL-4刺激巨噬细胞18 h将其诱导成M2型巨噬细胞模型。利用酶联免疫法(ELISA)法检测细胞培养上清中IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、CCL17和CCL18的浓度;RT-PCR检测M1型巨噬细胞标志物(CXCL10、CXCL11、Nos2)和M2型巨噬细胞标志物(CCL17、CCL18、CCL22)的mRNA表达;流式细胞术检测巨噬细胞CD86和CD206表达,以验证M1、M2细胞是否诱导成功。2.利用高通量Arraystar human lncRNA芯片比较未极化巨噬细胞(M0)、M1和M2之间lncRNA和mRNA表达谱差异。对差异表达的mRNA分别进行GO分析和KEGG pathway分析。选取6个差异表达lncRNA进行RT-PCR检测,验证芯片结果的准确性。3.以IL-4刺激M1型巨噬细胞,以IFN-γ及LPS刺激M2型巨噬细胞,检测M1、M2型巨噬细胞相关分子,验证M1、M2细胞重极化模型是否诱导成功。采用RT-PCR检测lncRNA NEAT1在M1/M2重极化过程中的表达变化。4.设计并合成针对NEAT1基因的siRNA及无关序列,转染巨噬细胞,48 h后,以IFN-γ及LPS诱导巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化,以IL-4诱导巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化,采用ELISA检测细胞因子IL-12及IL-10的分泌量;RT-PCR检测M1、M2巨噬细胞相关分子表达。将NEAT1 siRNA转染M1型巨噬细胞,检测其对M1极化表型的影响。结果:1.经IFN-γ及LPS刺激的人单核细胞来源巨噬细胞中CD86高表达,IL-6、IL-12和TNF-α分泌水平明显增加,CXCL10、CXCL11和Nos2表达增加,符合M1型巨噬细胞的特点;经IL-4处理的人单核细胞来源巨噬细胞中CD206高表达,IL-10、CCL17和CCL18分泌水平明显增加,CCL17、CCL18和CCL22表达增加,符合M2型巨噬细胞的特点。2.芯片结果显示不同极化类型巨噬细胞间lncRNA和mRNA表达差异显著:在lncRNA中,M1与M0间共9343条lncRNA异常表达;M2与M0间共4592条lncRNA异常表达;M2与M1间共有10480条lncRNA异常表达。在mRNA中,M1与M0间共5903条lncRNA异常表达;M2与M0间共3122条lncRNA异常表达;M2与M1间共有7062条lncRNA异常表达。3.GO分析发现巨噬细胞极化过程中差异表达的mRNA主要与免疫应答、免疫系统进程、防御反应、固有免疫应答、趋化因子活性、细胞因子活性、细胞外间隙、细胞膜等方面有关联。Pathway分析发现这些差异表达的mRNA参与细胞因子间相互作用、TNF信号通路、趋化因子信号通路、NK-κB信号通路、NOD信号通路、MAPK信号通路、脂肪酸代谢、PPAR信号通路、癌症通路等。RT-PCR验证结果与芯片检测结果一致。4.当体外刺激条件改变时,M1、M2巨噬细胞均可发生重极化。RT-PCR结果显示,M1型巨噬细胞的lncRNA NEAT1表达水平显著高于未极化细胞和M2型巨噬细胞。M1向M2极化转换过程中lncRNA NEAT1表达逐渐降低;而M2向M1极化转换过程中lncRNA NEAT1表达逐渐升高。5.NEAT1 siRNA转染巨噬细胞后,经IFN-γ及LPS诱导的M1型巨噬细胞中IL-12分泌降低,CXCL10和CXCL11 mRNA表达水平下降;而经IL-4诱导的M2巨噬细胞中IL-10分泌增加,CCL17和CCL18 mRNA表达升高。此外,NEAT1 siRNA转染M1型巨噬细胞后,M1型巨噬细胞中IL-12分泌降低,IL-10分泌增加,其特点向M2样巨噬细胞转换。结论:1.体外培养条件下,IFN-γ及LPS能够诱导人单核来源巨噬细胞向M1型极化;IL-4能够诱导人单核来源巨噬细胞向M2型极化。2.利用高通量lncRNA芯片筛选了不同极化类型人巨噬细胞间差异表达的lncRNA和mRNA。通过GO、Pathway分析对差异表达的mRNA进行分析,初步分析显示这些异常表达mRNA可能在巨噬细胞极化过程中发挥作用。利用RT-PCR对部分差异表达lncRNA进行验证,检测结果与芯片检测结果一致,证实了芯片检测结果的可靠性。3.lncRNA NEAT1在M1巨噬细胞中高表达,参与调控巨噬细胞极化,干扰lncRNA NEAT1表达可有效抑制M1型巨噬细胞极化,并可诱导M1型巨噬细胞重极化为M2型。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392

【参考文献】

相关期刊论文 前8条

1 姚芳苡;黄自坤;熊国亮;彭亦平;李俊明;傅颖媛;;肺结核患者外周血单个核细胞中lncRNA NEAT1的检测及临床意义[J];实验与检验医学;2017年01期

2 Nadire Duru;Benjamin Wolfson;Qun Zhou;;Mechanisms of the alternative activation of macrophages and non-coding RNAs in the development of radiation-induced lung fibrosis[J];World Journal of Biological Chemistry;2016年04期

3 张颖;王永福;;巨噬细胞极化相关机制的研究进展[J];细胞与分子免疫学杂志;2016年11期

4 陈林;葛付涛;沙辉;叶龙;赵松;牛丰;;血清长链非编码RNA CRNDE-h、GAS5检测在预测多发性骨髓瘤预后中的价值分析[J];中国实验诊断学;2016年05期

5 毕佳;曾宪鑫;魏敏杰;赵琳;;microRNA调控巨噬细胞极化的研究进展[J];细胞与分子免疫学杂志;2015年11期

6 张飞飞;沈南;唐元家;;LncRNA NEAT1参与TLR2介导的炎症因子的表达[J];现代免疫学;2015年04期

7 鲁宏伟;蔡军伟;刘靖华;;巨噬细胞的极化及其调控的信号分子和转录因子[J];细胞与分子免疫学杂志;2013年07期

8 黄自坤;李俊明;;巨噬细胞极化及其在感染性疾病中的作用[J];国际免疫学杂志;2012年04期

，

本文编号：2370605