【摘要】：腺病毒载体在基因治疗和重组疫苗研究中有着广泛的应用。腺病毒是无包膜的双链DNA病毒,人腺病毒(human adenovirus, HAdV)共有50多个血清型,分为A-G共7个组(种),它们对机体的感染部位和引发的疾病类型各不相同。最常用的腺病毒载体是基于HAdV5构建的,HAdV5属于HAdV-C,主要感染上呼吸道,靶细胞是呼吸道上皮细胞,细胞表面的病毒受体是CAR。本实验室建立了HAdV41载体系统。HAdV41属于HAdV-F,被称为肠腺病毒,能引起腹泻,是天然的肠道病原；HAdV41的靶细胞可能是肠道上皮细胞,它的细胞受体还没有完全阐明。HAdV5与HAdV41的生物学特性存在较大差异,以它们为载体的重组疫苗在宿主引发的免疫反应可能不同。中东呼吸道综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)初次发现于2012年,是一种可引起类似于急性呼吸道综合征(SARS)疾病并有高致死率的新发人类冠状病毒。MERS-CoV已成为巨大的公共健康威胁,但目前还没有有效的疫苗或治疗方案来应对可能的MERS-CoV爆发。冠状病毒的刺突(spike, S)糖蛋白是病毒粒子外膜的特征性结构组分,在病毒吸附和进入靶细胞时发挥重要作用,是冠状病毒的主要中和抗原。本研究设计并构建了表达MERS-CoV S蛋白的重组HAdV41 (rHAdV41)和重组HAdV5 (rHAdV5),采用灌胃和肌肉注射的免疫方式,在小鼠模型观察了细胞免疫和体液免疫效果。并构建了共表达绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)报告基因的重组腺病毒,利用活体成像技术和体外组织荧光素酶(luciferase)活力检测两种方法,检测了不同感染途径,在不同时间点,外源基因在小鼠体内各种组织的表达情况。1.疫苗载体在小鼠模型的免疫效果评价目的构建MERS-CoV重组腺病毒疫苗,并观察其在小鼠模型的免疫效果,为控制MERS-CoV的感染和传播探索可能的疫苗方案。方法在课题组已有研究基础上,将MERS-CoV S基因插入腺病毒E1缺失区,构建可以表达MERS-CoVS蛋白的rHAdV41和rHAdV5(HAdV41-MERS-S和HAdV5-MERS-S),分别利用已有的包装细胞系293TE32细胞和293细胞进行拯救并扩增。同时构建了携带GFP基因的2种对照病毒HAdV41-GFP和HAdV5-GFP。Hirt法提取重组腺病毒基因组,通过酶切、PCR进行鉴定；Western blot和间接免疫荧光法(IFA)鉴定重组腺病毒感染细胞后外源蛋白MERS-CoV S蛋白的表达。扩增重组腺病毒,采用CsCl密度梯度超速离心纯化,采用消化法测定病毒颗粒数滴度,再通过有限稀释法测定其感染滴度。HAdV41-MERS-S以5×10.vp(viral particle)每只为免疫剂量,HAdV5-MERS-S以1×109Vp每只为免疫剂量,采用肌肉注射(i.m.)100μl每只、灌胃(i.g.)500μl每只两种给药途径免疫小鼠,4周后,处死半数小鼠,取血清测定IgG.IgA和中和抗体,血清、肺灌洗液、小肠、大肠测定IgA,脾和肺淋巴细胞测定细胞因子；16周后处死余下半数小鼠,同样对体液免疫和细胞免疫效果进行评价。结果成功进行了腺病毒质粒的构建和重组病毒的拯救。Hirt法提取重组腺病毒基因组后,酶切鉴定和PCR扩增目标序列的结果与预期一致;Western blot和间接免疫荧光检测结果显示,所得到的重组腺病毒可以表达MERS-CoV S蛋白。扩增纯化后得到2.3 ml HAdV41-MERS-S,其颗粒滴度为5.71×1011vp/ml,感染滴度为2.7×10.IU/ml(infectious unit per milliliter)；得到2.3 ml HAdV5-MERS-S,其颗粒滴度为3.57×1012 vp/ml感染滴度为1.3×1011IU/ml.同时成功制备纯化了对照病毒。经肌肉注射免疫小鼠,免疫4周后,实验组每组(n=5)100%小鼠体内都产生了MERS-S特异性的IgG抗体；用HAdV41-MERS-S免疫鼠有20%体内产生了MERS-S特异性的中和抗体,用HAdV5-MERS-S免疫,小鼠体内中和抗体检出率为100%；各组小鼠体内IgA抗体均未检测到；但脾细胞和肺淋巴结都可检测到抗原特异性T细胞应答。肌注免疫16周后,实验组抗原特异的IgG抗体、中和抗体和T细胞应答仍可检测到。经灌胃途径免疫,4周后,2种病毒载体实验组均有60%小鼠体内产生了MERS-S特异性的IgG抗体(n=5)；HAdV41-MERS-S免疫组,有40%小鼠体内产生了MERS-S特异性的中和抗体,HAdV5-MERS-S免疫组小鼠体内中和抗体检出率为60%；实验组血清、肺灌洗液、小肠和大肠都可以检测到抗原特异的IgA抗体,但抗原特异的T细胞应答未检出；16周后,实验组抗原特异的IgG、IgA和中和抗体仍可检测到。结论采用肌肉注射免疫途径,HAdV41-MERS-S和HAdV5-MERS-S单次免疫即可激发脾细胞和肺淋巴结的抗原特异性T细胞应答,且可持续数月,但IgA抗体并未检测到。采用灌胃免疫途径,HAdV41-MERS-S和HAdV5-MERS-S都可产生抗原特异的IgA抗体,在血清和多种粘膜表面均有检出；但抗原特异的T细胞应答未检测到。肌注和灌胃两种免疫途径均可有效激发小鼠产生IgG抗体和中和抗体。2.疫苗载体在小鼠模型的体内分布目的观察重组腺病毒HAdV41和HAdV5在小鼠模型的体内分布,为疫苗载体的安全性评价提供参考。方法分别以pLEGFP-C1和pGL4.17质粒为模板,用PCR扩增绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)报告基因,酶切后与空穿梭质粒的酶切产物连接,构建携带目的基因的穿梭质粒psh41GFP-T2A-Luc和psh5GFP-T2A-Luc。含目的基因的穿梭质粒经酶切、PCR和测序鉴定后,与骨架质粒共转化BJ5183感受态细胞,构建共表达GFP和firefly luciferase报告基因的重组腺病毒质粒pAdV41GFP-T2A-Luc和pAdV5GFP-T2A-Luc。用lipofectamine 2000分别转染包装细胞系293TE32细胞和293细胞,进行拯救和扩增,得到重组腺病毒HAdV41GFP-T2A-Luc和HAdV5GFP-T2A-Luc。Hirt法提取重组腺病毒基因组,限制性酶切和PCR进行鉴定；蛋白水平上,用重组腺病毒感染A549细胞,通过观察荧光和luciferase assay检测GFP和荧光素酶的表达。扩增的重组腺病毒采用CsCl密度梯度进行纯化,消化法测定病毒颗粒数滴度,有限稀释法测定感染滴度。HAdV41GFP-T2A-Luc和HAdV5 GFP-T2A-Luc分别以5×109Vp和1x109vp每只的感染剂量,采用肌肉注射(100μl每只)或灌胃(500μl每只)两种给药途径感染小鼠。在感染后4h、18 h、48 h、7d,利用活体成像技术进行活体观察荧光素酶的表达；在对应时间点每组处死2只小鼠,取17种共19样组织,提取活性蛋白后,用luciferase assay试剂盒检测荧光素酶在不同组织的分布。结果成功构建了重组腺病毒质粒并拯救出相应的重组病毒,在病毒基因组水平,限制性酶切和PCR鉴定结果与预期一致。感染A549后,荧光观察和luciferase活力测定结果显示重组病毒表达GFP和荧光素酶。扩增纯化后,得到1.65ml HAdV41GFP-T2A-Luc,颗粒滴度为7.6×1010vp/ml,感染滴度为2.9×108 IU/ml;得到2.11ml HAdV5GFP-T2A-Luc,颗粒滴度为4.2×1011vp/ml,感染滴度为3.1×1010 IU/ml。2种病毒经肌肉注射途径感染,活体成像和体外酶活测定的结果均表明病毒主要分布在注射部位,目的基因表达强,在肝和脾报告基因表达较弱检出,随着时间延长逐渐减弱。HAdV41GFP-T2A-Luc经灌胃途径感染小鼠,活体成像结果表明,仅在感染后18h,小鼠口鼻部可见较弱荧光,其他时间点或在其他部位未检测到；体外组织检测结果表明,在感染后4h和18h,在消化道(派氏结、小肠下段、大肠)可以检测到较弱的luciferase表达。HAdV5GFP-T2A-Luc经灌胃途径感染小鼠,活体成像结果表明,在感染后18h和48h,小鼠口鼻部可见较弱荧光；体外组织检测结果表明,在消化道(派氏结、小肠下段、大肠)、气管和肺可以检测到较弱的luciferase表达。结论在小鼠体内,HAdV41和HAdV5经肌注途径感染,主要分布在注射部位,少量分布在肝和脾；经灌胃途径感染,目的基因表达较弱,主要分布在消化道。总之,我们成功构建了携带MERS-CoV S基因的重组HAdV41和HAdV5,单次免疫小鼠,能够激发小鼠产生相应的体液免疫和细胞免疫；利用报告基因系统,观察了重组病毒感染后在小鼠体内的分布情况,部分解释了重组疫苗灌胃给药后机体产生免疫反应较弱的原因。本研究为MERS-CoV疫苗研发进行了有益的探索；首次观察了重组HAdV41灌胃后目的基因在小鼠体内的表达分布,丰富了HAdV41病毒学的内容,为HAdV41载体进一步开发利用打下了基础。研究结果同时提示小鼠不是理想的研究HAdV41口服感染的动物模型。
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【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
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