应用高密度细胞发酵技术在大肠杆菌中生产重组HDV抗原并建立ELISA方法检测HDV的感染

发布时间：2018-12-14 21:12

【摘要】：丁型肝炎病毒是依赖于乙型肝炎病毒的缺陷性病毒,丁型肝炎病毒的感染通常伴随更严重的肝损伤,给患者带来了沉重的身体和经济负担。丁型肝炎病毒是单链环状RNA病毒,基因组约1.7kb。病毒的基因组只能编码一个蛋白,在翻译过程中由于宿主细胞的编辑作用会产生两种形式的蛋白。除去在羧基端延伸增加的19个氨基酸外,其它部分的性质完全一致,两种形式的蛋白均可刺激机体产生特异的免疫反应。当机体被丁肝病毒感染时,会持续产生特异性的不同类型的抗体,包括IgM和IgG。丁肝病毒抗原是用于血清学诊断的唯一的也是有效的候选抗原。通过现代基因技术,可以大规模表达和纯化具有生物学活性的重组丁肝抗原。配合逐步兴起的高密度发酵技术,获得大量的活性蛋白,是将实验室和市场结合,科研转化为应用的重要步骤。本实验在大肠杆菌偏好密码子的基础上,重新编码了丁肝病毒抗原的基因序列,新的序列的GC含量为51.2%,不含有重复序列和不利于表达的顺式元件,如SD相似序列等。将新的序列插入在pet43.1a表达载体,利用T7聚合酶强大的转录能力,在E.coli BL21 (DE3)菌株中可以大量表达重组蛋白,表达蛋白量可以达到总蛋白的23.6%。重组丁肝抗原以可溶性形式表达,保留了生物学活性,同时省去了复性等的操作。应用高密度发酵技术表达重组丁肝抗原,先后从接种量,发酵使用的碳源,氮源,反馈补料方式,诱导方式和诱导时间方面进行实验探索,最终确定了使用以碳源为控制因素的分批补料高密度发酵技术。在接种量为5%的条件下,利用葡萄糖作为控制碳源,控制菌体的比生长速率为0.12h-1,使用乳糖诱导一个小时后,添加1mm IPTG作为诱导剂继续诱导3个小时,诱导时补料培养基中添加10g/L的酵母粉。经过分批补料发酵后,菌体OD600吸光值可以达到62,诱导后重组蛋白的量约占细菌蛋白总量的20%,通过细胞干重和蛋白直接的关系,可以计算得到了0.5g/L的重组丁肝抗原,已经达到了高密度细胞发酵的标准。表达的重组丁肝抗原可以使用固定化金属离子螯合层析技术纯化得到。首先利用超声的方法将细菌破碎,在12000*g的条件下离心去除不溶的细胞碎片等杂质。利用重组丁肝抗原融合表达的6*his-tag可以与过渡态的金属离子特异性结合的性质,进行依赖镍离子的固定化金属螯合层析。在推荐使用的0.5mol/LNaCl时,金属离子和His-tag并不能结合,当经过1mol/LNaCl作用后,金属离子可以结合重组丁肝抗原。通过改变缓冲液中NaCl的浓度,利用同一种方法,可以得到纯度高于98%的重组丁肝抗原。高浓度的盐对于重组丁肝抗原的纯化是必须的,处理后的抗原与抗体结合的能力显著增加。推测可能的原因是高盐浓度改变了重组丁肝抗原的构象,使得构象接近天然构象有利于和抗体的结合,同时暴露出his-tag与金属离子结合。建立间接法测定血清中的IgG抗体：用重组丁肝抗原包被ELISA板,每孔约10ng。将待测血清稀释10倍后,加入50微升在预包被了重组丁肝抗原的微孔中,在37℃条件下孵育30分钟,使用PBST洗板5次后,加入HRP标记的鼠抗人IgG抗体,37℃条件下孵育30分钟,加入底物A液和B液各50微升,混匀后反应10min,加入1.8mol/L的硫酸终止反应。使用双波长450/630nm检测每孔的吸光值。建立了捕获法测定血清中的IgM抗体：在预包被了鼠抗人IgM的ELISA板加入待检血清50微升,混匀后37℃条件下反应30分钟。使用PBST洗板5次后加入100微升HRP标记的重组丁肝抗原,37℃孵育30分钟后使用PBST洗板5次,加入A液和B液反应15分钟后终止反应,检测方法同间接法。使用1270份阴性血清确定了两种方法的cut-off值,对于间接法,当吸光值0.15判定为阴性,吸光值0.15时判定为阳性结果。捕获法的判定结果与间接法相同。使用30份已知阳性标本,90份非丁肝患者的血清检验特异性和敏感性,两种检测方法的敏感性和特异性均达到了95%以上。本实验建立了依赖重组重组丁肝抗原的血清学检测方法,具有良好的特异性和敏感性。综上所述,本实验成功构建了重组丁肝病毒抗原的原核表达载体,在BL21(de3)菌株中可以高效表达重组蛋白。应用高密度细胞发酵技术,可以得到0.5g/L的重组丁肝抗原。使用亲和层析,仅需改变盐离子的浓度,可以获得高活性高纯度的重组抗原。重组丁肝抗原可以用于ELISA试剂盒的检测,依赖于重组丁肝抗原建立了间接法和捕获法测定血清中的特异性抗体,符合临床中对试剂盒的要求。本实验探索了利用高密度细胞发酵技术在大肠杆菌中高效表达重组抗原的技术。这项技术在当前的医药行业和体外诊断等领域具有较强的应用价值,为其他蛋白的大规模生产和应用具有指导意义。
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【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
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本文编号：2379327