【摘要】：结核分枝杆菌(M.tuberculosis),俗称结核杆菌,是结核病的病原体。据世界卫生组织统计,每年全世界新发生病例约900万例,每年死亡300万人,而这些死亡人口多集中在经济、卫生、医疗环境相对落后的发展中国家。而中国是结核病高发国,仅次于印度。目前对结核病的诊断方法主要为细菌学检查与结核菌素试验,试验周期长,因此,寻找和建立结核病快速诊断方法一直是人们所研究的重点。而结核分枝杆菌38KD蛋白因其在多种结核相关抗原中特异性和灵敏度均较高,更因其特有的强免疫原性成为结核分枝杆菌抗原的研究热点。结核分支杆菌早期分泌性抗原靶(ESAT-6)具有较强的细胞免疫活性,能够被有免疫活性的T细胞识别,生成大量的干扰素γ,从而产生保护性的细胞免疫,维持长期恒久的免疫记忆,因此有望成为人及动物结核病的特异性诊断试剂及疫苗开发侯选抗原。本研究利用本实验室早期建立的实验方法,对结核分枝杆菌38KD及ESAT-6蛋白进行序列优化合成、构建真核表达载体并实现其在哺乳动物细胞中的大量分泌性表达。本研究分为四个部分,第一部分我们成功构建了含结核分枝杆菌38KD蛋白基因的真核表达载体并转染HEK 293T细胞,实现高效表达分泌性38KD蛋白。设计合成的结核分枝杆菌38KD基因被克隆到T载体,然后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.0,经酶切鉴定正确后,PEI转染法导入293T细胞。24h后换无血清的DMEM培养基继续培养3天后收集细胞及上清,采用Western Blot方法检测38KD蛋白的表达。酶切结果显示,获得正确的含38KD基因的重组表达载体;Western Blot结果显示,载体导入293T细胞后在细胞内及上清中都能检测到38KD蛋白表达。说明我们成功构建了含结核分枝杆菌38KD蛋白基因的重组真核表达载体pCDNA3.0-38KD,该载体可在哺乳动物细胞293T中高效分泌性表达38KD蛋白。第二部分我们构建了一个38KD蛋白与eGFP共表达的慢病毒载体pLV-38KD-IRES-eGFP 以及只表达 38KD 蛋白的 pLV-38KD,以研究 IRES-eGFP对38KD蛋白表达的影响。首先我们将携带有38KD基因的T载体及慢病毒载体用Mlu I和Nhe I双酶切后构建到慢病毒载体pLV-CMV-IRES-eGFP中得重到38KD蛋白与eGFP共表达载体pLV-38KD-IRES-eGFP;后者用Mlu I和Sal I双酶切,去掉IRES-eGFP片段得到只表达38KD蛋白的载体pLV-38KD。将上述两个表达载体用PEI转染法导入293T细胞,24h后换无血清的DMEM培养基继续培养3天后收集细胞及上清,采用Western Blot方法检测38KD蛋白的表达。酶切结果显示,获得正确的含38KD蛋白基因的慢病毒表达载体pLV-38KD-IRES-eGFP 及 pLV-38KD;Western Blot 结果显示,载体导入 293T细胞后在细胞及上清中均能检测到38KD蛋白的表达,且去除IRES-eGFP的慢病毒表达载体,38KD蛋白的表达量明显比38KD蛋白与eGFP共表达的慢病毒载体表达量高。说明我们成功构建38KD蛋白与eGFP共表达以及只表达38KD蛋白的慢病毒表达载体,这两种载体均可在哺乳动物细胞293T中高效分泌性表达38KD蛋白,IRES-eGFP对38KD蛋白的表达有明显抑制作用。基于第二部分的研究,我们继续探讨IRES-eGFP对其它基因表达的影响。通过类似方法,我们构建一个带有结核分枝杆菌ESAT-6基因的共表达载体pLV-ESAT-6-IRES-eGFP及只表达ESAT-6基因的慢病毒载体pLV-ESAT-6。酶切结果显示我们成功构建了含结核分枝杆菌ESAT-6蛋白基因的慢病毒表达载体pLV-ESAT-6-IRES-eGFP 和 pLV-ESAT-6,Western Blot 结果显示两个载体均可在哺乳动物细胞293T中高效分泌性表达ESAT-6蛋白,IRES-eGFP对ESAT-6蛋白表达也有明显抑制作用。第四部分,通过ELISA方法进一步验证38KD和ESAT-6蛋白的免疫原性。利用真核表达系统高效表达结核分枝杆菌38KD蛋白和ESAT-6蛋白,血清学鉴定结果显示,两种蛋白均能与结核病阳性血清发生免疫反应,ELISA反应阳性率为71.43%和100%,说明表达出来的蛋白均具有免疫原性和较高的灵敏度。通过上述方法,我们成功构建了含结核分枝杆菌38KD蛋白基因的真核表达载体,通过转染HEK-293T细胞初步鉴定38KD蛋白可以在哺乳动物细胞中高效分泌性表达;而我们构建的含38KD蛋白基因的重组慢病毒表达载体也成功在HEK-293T细胞中表达,且IRES-eGFP对38KD蛋白的表达有明显抑制作用。通过类似方法构建含结核分枝杆菌ESAT-6基因的慢病毒载体,实验结果也表明IRES-eGFP对ESAT-6蛋白表达同样有明显抑制作用,其原因尚待进一步研究。血清学结果显示,本研究中表达的38KD蛋白和ESAT-6蛋白均具有免疫原性和较高的灵敏度。本研究获得了高效表达重组结核分枝杆菌38KD和ESAT-6蛋白的真核表达载体,为后续建立稳定高量38KD蛋白和ESAT-6蛋白生产平台以及结核分枝杆菌诊断试剂盒的研发和疫苗的开发奠定基础。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R378.911
【参考文献】
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2380640
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