钩端螺旋体LigA、LigB Big结构域和布氏锥虫Q388A3 PDZ结构域的结构与分子机制研究

发布时间：2019-07-31 10:50

【摘要】：本论文主要研究了致病性钩端螺旋体外膜蛋白LigA Big、LigB Big结构域和布氏锥虫Q388A3 PDZ结构域的结构以及其分子作用机制。1.致病性钩端螺旋体能够表达具有免疫球蛋白结构的粘附因子,它们能够结合宿主细胞的多种细胞外基质成分。Lig(Leptospiral immunoglobulin-like)蛋白家族是具有超大分子量的存在于致病性钩端螺旋体中的蛋白,他们都属于免疫球蛋白超家族。LigA(Leptospiral immunoglobulin-like proteinA)是含有串联的Big(Bacterial immunoglobulin-like)结构域的一种外膜蛋白。研究表明LigA参与了致病性钩端螺旋体与哺乳动物宿主细胞的结合的过程。我们利用NMR(nuclea magnetic resonance)波谱学的方法解析了 LigA中第四个Big结构域,LigA4 Big结构域。通过与其他的Big结构域比较发现LigA4 Big结构域的溶液结构呈现一种类似的细菌免疫球蛋白样折叠,暗示着Big结构域家族拥有一些相同结构特征。此外,LigA4 Big结构域表现出一些明显不同于经典的免疫球蛋白结构域的结构特征。另一方面,Strains-all染料结合实验和NMR化学位移微扰实验揭示了 LigA4 Big结构域具有钙离子结合的特性。LigB是Lig蛋白家族中另一种膜表面蛋白并含有串联的Big结构域和一个非串联的末端。经实验鉴定,LigB参与致病性钩端螺旋体与宿主细胞的粘附过程。LigB其中一个串联的Big结构域(LigBCen2R Big结构域)能够与细胞外基质成分纤粘蛋白的GBD(gelatin-binding结构域)结合,暗示了 LigB在钩端螺旋体侵染过程中可能起到重要作用。我们利用核磁共振波谱学的方法解析了 LigBCen2RBig结构域的溶液结构。LigBCen2RBig结构域的结构中的10个β折叠片分布在3个不同的片层中,呈现出的免疫球蛋白样折叠模式。ITC(isothermal titration calorimetry)实验结果表明 LigBCen2R Big 结构域对钙离子有很强的亲和力。NMR化学位移微扰试验鉴定出一些可能与钙离子结合相关的一些氨基酸残基。通过结构比较发现LigBCen2R Big结构域与其他的Big结构域的有着相同的折叠模式同时也存在一些自身特有的特征。由于Lig蛋白家族在侵染宿主细胞过程中起到至关重要的作用,我们的研究为更好的理解钩端螺旋体侵染机制提供了结构基础。2.PDZ结构域是普遍存在蛋白相互作用的模块之一,能够识别靶蛋白羧基端的一段保守序列,总是存在于支架蛋白中。布氏锥虫是一种能引起人类瞌睡病的真核寄生生物,我们首次研究了布氏锥虫蛋白中的PDZ结构域。Q388A3是布氏锥虫中未知功能蛋白,全长有1634个氨基酸残基包含一个位于羧基端的PDZ结构域。我们通过NMR波谱学的方法解析了 Q388A3 PDZ结构域的溶液结构。Q388A3PDZ结构域由5个β折叠片形成的片层以及包在外围的2个α螺旋构成的PDZ样折叠模式。并且它与HtrA家族蛋白中的PDZ结构域的结构类似。同时,Q388A3 PDZ结构域结构呈现出一些与HtrAPDZ结构域截然不同的结构特征。NMR化学位移微扰以及表面离子共振试验结果表明Q388A3 PDZ结构域能够结合OMP(outer membrane porins)-like小肽。除此之外,我们通过点突变和表面离子共振技术鉴定出参与Q388A3 PDZ结构域与小肽结合的关键性氨基酸残基。PDZ结构域对小肽的亲和能力受到小肽结合区域的关键氨基酸残基以及其结构的直接影响。
【图文】：

钩端螺旋体的细胞壁具有革兰氏阴性（Ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ）细菌的细胞壁特点逡逑（图１．２）。细胞膜可分为细胞内膜和细胞外膜（Ｃｕｌｌｅｎ邋ｅｔａｌ．，２００４）。肽聚糖层紧逡逑贴细胞内膜，并且有ＦｅｏＡ－ＦｅｏＢ型离子通道、青霉素结合蛋白（ＰＢＰ）以及脂蛋逡逑白ＬｉｐＬ３１穿插在他们当中（Ｌｏｕｖｅｌ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００６）。钩端螺旋体的细胞外膜包含脂逡逑多糖ＬＰＳ邋（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、横跨外膜的孔蛋白ＯｍｐＬｌ、细胞外膜内表面脂逡逑蛋白ＵｐＬ３６以及外膜内表面ＬｉｐＬ３２、ＬｉｐＬ４１和ＬｉｇＢ等。通过基因组分析鉴定逡逑出若干个ＴｏｎＢ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ受体（ＴＢＤＲ），其中三个参与梓檬酸铁（ｉｒｏｎｃｉｒａｔ），逡逑去铁敏（ｄｅｓｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅ）以及血红素转运（Ａｓｕｔｈｋａｒｅｔａｌ．，邋２００７），所需的能量逡逑由位于内膜的ＴｏｎＢ－ＥｘｂＸ－ＥｘｂＤ复合体转化提供。致病性钩端螺旋体具有类似逡逑大肠杆菌的输出系统能够转运外膜蛋白以及脂蛋白（Ｂｏｓ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００７）。脂蛋白首逡逑先通过Ｓｅｃ系统进行运输然后与由ＬｏｌＤ、ＬｏｌＣ以及ＬｏｌＥ构成的ＡＢＣ转运子逡逑结合。而ＯＭＰ首先由Ｓｅｃ易位子转运，接下来在整合到磷脂双分子层（Ｈｐｉｄ逡逑ｂｉｌａｙｅｒ）之前先后与周质伴侣Ｓｋｐ以及ｏｍｐ８５结合。在钩端螺旋体的胞质膜中逡逑也发现了若干个ＡＢＣ转运子，其中包括一个金属阳离子摄取家族ＡＢＣ转运子逡逑（Ｌｏｕｖｅｌ邋ｅｔａｌ．，，邋２００６）。和其他螺旋菌属类似，内生表毛位于细胞周质（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）逡逑

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本文编号：2521272