黑龙江立克次体感染早期Tim-3的免疫学作用研究

发布时间：2019-08-26 14:17

【摘要】：立克次体是严格细胞内寄生的革兰氏染色呈阴性的致病微生物,立克次体感染能够引起立克次体病。立克次体病主要有:斑点热、恙虫病、斑疹伤寒等等。立克次体病是一类呈世界性分布的、严重威胁人类健康的人兽共患的自然疫源性疾病。其中斑点热是由斑点热群立克次体感染引起。主要的斑点热包括立氏立克次体(R.rickettsii)引起的落矶山斑点热(Rocky Mountain Spotted Fever,RMSF)、康氏立克次体(R.conorii)引起的地中海斑点热(Mediterranean Spotted Fever,MSF)、澳大利亚立克次体(R.australis)引起的昆士兰斑点热(Queensland Spotted Fever,QSF)、小蛛立克次体(R.akari)引起的立克次体痘(Rickettsial Pox)等。斑点热的潜伏期为4~7天,主要表现为发热、头痛、肌肉痛和皮疹等症状。其中立氏立克次体引起的落矶山斑点热临床症状最为严重,如果得不到及时治疗,感染者大多会因为肾功能衰竭而死亡。斑点热在我国广泛存在,主要有由西伯利亚立克次体(R.sibirica)引起的北亚热(North Asian Tick-borne Rickettsiosis)和由黑龙江立克次体(R.heilongjiangensis)引起的远东斑点热(Far East Spotted Fever)。黑龙江立克次体引起的远东斑点热是东北亚洲地区的一种新发传染病。感染者可有发热、寒颤、头痛、肌肉痛、关节痛、厌食、以及黄斑或斑丘疹等症状,合并有肝肿大和谷丙转氨酶和/或天冬氨酸转氨酶活性升高等肝脏损伤表现。用黑龙江立克次体感染小鼠,小鼠会表现出严重的全身感染症状,并伴随有肺、肝、脾、脑组织损伤。最初T细胞免疫球蛋白和粘附分子-3(Tim-3)被认为是Th1细胞的特异性受体,它通过调节Th1细胞的功能,维持免疫平衡和免疫耐受。大量的研究表明,Tim-3也表达于天然免疫细胞,包括:单核/巨噬细胞、树突状细胞(DCs)和自然杀伤细胞(NK)等,并且Tim-3通过选择性的活化天然免疫细胞促进免疫平衡。另外,有研究发现Tim-3也表达于人类血管内皮细胞(ECs)。近些年,Tim-3在抗感染免疫方面的研究受到越来越多的关注。Tim-3信号通路可以在病毒、胞外菌、胞内菌的感染中,发挥抗感染的免疫调节作用。但是,Tim-3在专性细胞内寄生菌——立克次体感染中的免疫学作用还不清楚。血管内皮细胞是立克次体感染最主要的靶细胞。入侵宿主后,立克次体主要在血管内皮细胞生长和繁殖。在立克次体感染过程中,血管内皮细胞被激活并释放大量细胞因子,这些细胞因子在抗感染免疫中发挥重要的作用。本课题从动物水平、细胞水平和分子水平三个层面研究探讨:tim-3是否参与立克次体感染早期过程;tim-3是增强或抑制机体抗立克次体免疫应答;其作用机制是什么?首先,我们经腹腔注射法用黑龙江立克次体感染小鼠,再分别用qpcr法和rt-pcr方法检测感染1~3天内小鼠脾脏的立克次体载量变化和tim-3mrna表达量的变化。结果发现立克次体感染3天内,小鼠脾脏立克次体数量随着感染时间延长而逐渐增加,tim-3mrna表达水平则呈现逐渐下降的趋势。用黑龙江立克次体感染体外培养的血管内皮细胞系(ea.hy926),结果显示感染后3天内,内皮细胞内立克次体数量逐渐增多,内皮细胞的tim-3mrna表达水平则逐渐下降。体内、外实验结果一致,因此tim-3参与了立克次体感染早期机体的免疫应答过程。tim-3参与了立克次体感染早期的免疫应答,那么它在该过程中发挥怎样的免疫调节作用呢?我们假设tim-3能够促进机体或者血管内皮细胞清除/杀伤细胞内立克次体。为了证明这一假说,我们使用小鼠tim-3胞外段与人igg1-fc融合蛋白(mtim-3-ig)阻断小鼠的tim-3信号通路,并用人igg1-fc蛋白(ig)作为同型对照。结果发现,tim-3信号通路阻断后,小鼠脾脏的立克次体数量明显增多,同时小鼠外周血中细胞因子(ifn-γ、tnf-α、il-2、il-18)和趋化因子rantes表达水平明显降低。这一结果提示,tim-3信号通路的阻断能够抑制宿主/宿主细胞的抗胞内寄生菌相关的免疫因素,进而促进立克次体感染。另外,用黑龙江立克次体感染tim-3高表达的转基因小鼠(tim-3-tg),我们发现立克次体感染后第3天,tim-3-tg小鼠无明显感染症状,而野生型对照小鼠感染症状则非常明显。并且,tim-3-tg小鼠外周血的抗胞内菌感染相关细胞因子和趋化因子水平显著高于野生型小鼠。该结果进一步证明,增加tim-3表达能够增强宿主抗立克次体免疫应答。黑龙江立克次体感染重组人tim-3-人igg1-fc融合蛋白(htim-3-ig)预处理的人血管内皮细胞(ea.hy926),结果发现,感染3天后该细胞内立克次体数量显著多于对照组细胞。这一结果说明,tim-3信号激活后能够诱导血管内皮细胞杀伤胞内立克次体。用黑龙江立克次体感染稳定高表达或低表达tim-3的ea.hy926细胞,立克次体感染3天后的结果显示,tim-3高表达细胞的立克次体数量显著低于对照细胞,而tim-3低表达细胞的立克次体数量显著高于对照细胞。综上所述,增加tim-3表达能够增强血管内皮细胞杀伤胞内立克次体的作用,而阻断tim-3信号或者抑制tim-3表达会抑制相关细胞因子和趋化因子的表达进而促进胞内立克次体的增加。Tim-3在立克次体感染的过程中具有增强机体的抗感染免疫反应。NO在杀伤胞内菌方面发挥重要作用。我们用细胞因子(RANTES、TNF-α、IFN-γ和IL-1β)鸡尾酒方法刺激人脐带静脉内皮细胞(HUVECs),并用黑龙江立克次体感染该细胞。实验结果显示,细胞因子鸡尾酒处理的内皮细胞产生的NO显著增加,同时胞内立克次体拷贝数减少,而受iNOS抑制剂NGMMLA作用的内皮细胞NO产生减少,且细胞内的立克次体数量增加。该研究明确证明,血管内皮细胞能够通过增加NO的合成去杀伤胞内立克次体。Tim-3能否通过增强血管内皮细胞产生的NO抑制立克次体感染?我们的实验结果显示,无论是阻断Tim-3信号通路还是降低Tim-3表达的血管内皮细胞,感染立克次体后,细胞iNOS mRNA表达水平明显降低,并且IFN-γmRNA表达水平也同样降低。这些数据提示,Tim-3信号通路的激活能够增强血管内皮细胞的iNOS表达,并通过增加NO的合成去杀伤细胞内的立克次体。我们还发现,Tim-3-Tg小鼠感染3天后,脾脏细胞iNOS、IFN-γ和TNF-α的mRNA表达水平显著高于野生型小鼠,而脾脏立克次体数量则显著低于野生小鼠。这些数据进一步说明,Tim-3信号通路的激活能够增强血管内皮细胞的NO合成,从而增强机体抑制立克次体感染。本课题证明,在黑龙江立克次体感染早期,Tim-3表达增强和Tim-3信号通路的激活,能够上调机体和血管内皮细胞对立克次体的杀伤作用,并明确了NO是血管内皮细胞杀伤胞内寄生立克次体的重要因素。本研究丰富了立克次体致病机制和抗立克次体免疫机制内容,为立克次体病的诊治提供了新的潜在靶标。
【图文】：

图 1-1. pRNAi-U6.1/Neo 质 图谱细胞瞬时转染24小时后，若细胞状态良好，则向细胞培养基中加入G418的筛选浓度为500 ng/ml。每3天给细胞换一次新的培养基（含500 ng/ml G418）。

并将其与pEGFP-N1/NeoR/KanR（图谱见图1-2.）连接，酶切位alⅠ，获得重组Tim-3的质粒。. 转染细胞系 步 骤 同 3.3 ，， 构 建 成 稳 定 高 表 达 Tim-3 的 EA.hy 926 细verexpression）；空载体转染细胞株（Vector）为同型对照。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392

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本文编号：2529355