荧光材料用于HIV-1病毒基因组成像

发布时间：2019-09-19 23:00

【摘要】：荧光材料在生物成像领域已得到广泛应用,选择合适的荧光材料作为指示信号也就成为了研究中的重点和难点。荧光材料需要满足荧光强度高,耐漂白,毒性小,体积小等要求。目前,常用的荧光材料主要包括:有机荧光探针、荧光蛋白、和量子点。本论文围绕荧光材料应用于HIV-1病毒基因组成像展开,取得以下主要进展:1)为了研究HIV-1在侵染宿主细胞早期阶段中的解离过程,我们构建了三种有侵染能力的双色荧光病毒(HIVRu-TC,HIVRu-EGFP,HIVTC-EGFp)和一种有侵染能力的三色荧光病毒(HIVRu-TC-ECFP)。结合这些多色荧光病毒颗粒和单颗粒成像技术,就可以追踪并观测到HIV-1的基质蛋白,衣壳蛋白以及基因组RNA在活细胞内的分离的全过程。在HIV-1早期侵染阶段,病毒颗粒多步解离过程首次被可视化观察到,我们采用最直观的方法解决了一个一直以来十分具有争议的问题。2)为了延迟钌的有机金属配合物的光漂白问题。我们在病毒颗粒的Vpr蛋白的C端插入了六个半胱氨酸,经过病毒的组装过程,这六个半胱氨酸与病毒基因组RNA相结合,通过自身的还原性来延迟钌的配合物的光漂白。基于这一光漂白的延迟效果,对HIV-1病毒颗粒进行单色基因组RNA的荧光标记,就可以在不改造病毒衣壳CA蛋白并且不影响病毒侵染能力的情况下,对病毒的脱壳过程进行成像。3)为了实现活细胞内HIV-1前病毒基因组的可视化成像,我们利用量子点(QDs)对TALE和CRISPR体系进行荧光标记,从而实现对靶向基因序列的识别和定位,同时解决单拷贝基因序列在活细胞内成像的技术难题。
【图文】：

ＨＩＶ基因组全长大约９．８邋Ｋｂ，共编码三个聚合蛋白（Ｅｎｖ，Ｐｏ丨和Ｇａｇ）和逡逑六个辅助蛋白（Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ和Ｎｅｆ），及两个长末端重复序列（ＬＴＲ）逡逑（图１－２）。Ｅｎｖ邋ｍＲＮＡ被表达并翻译成ｇＰＩ６０，然后由蛋白酶裂解为表面区逡逑（ｇｐｌ２０）和跨膜区（ｇＰ４１）两部分。ｇＰ１２０负责与受体ＣＤ４和辅助受体相结合，，逡逑而ｇｐ４１诱导病毒包膜与细胞膜相融合。Ｐｏｌ编码病毒蛋白酶（ＰＲ）、逆转录酶（ＲＴ）逡逑和整合酶（ＩＮ）。Ｇａｇ编码病毒的结构蛋白：基质蛋白（ｐｌ７ＭＡ）、衣壳蛋白（ｐ２４逡逑ＣＡ）、核衣壳蛋白（ｐ７ＮＣ）、ｐ６和间隔胎ＳＰ１、ＳＰ２。Ｇａｇ蛋白组装形成病毒衣逡逑壳；并在病毒出芽期间或刚刚完成出芽过程后，在蛋白酶的水解作用下裂解成为逡逑不同组分，结构产生很大变化并获得重要的生命功能［１７＿２２】。逡逑２逡逑

由Ｅｎｖ蛋白的负电性与细胞膜表面的一些正电性基团相结合。通过任何因素，逡逑都使ＨＩＶ－１病毒颗粒表面的Ｅｎｖ蛋白与细胞表面病毒的受体ＣＤ４和共同受体相逡逑互接近，进而增加ＨＩＶ－１病毒对对宿主细胞的侵染效率（图１－３）邋［３４’。逡逑３逡逑
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TQ422;R373

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本文编号：2538396