无创性轴向载荷建立兔腰椎间盘退变动物模型及其退变机制探索

发布时间：2019-09-21 05:47

【摘要】：椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是一个多因素导致的病理过程,其典型表现为髓核组织脱水、蛋白多糖缺失、细胞数量减少、纤维环排列紊乱及破裂等,是椎间盘突出症的主要病理基础,也是许多脊柱退行性疾病的使动原因。目前对椎间盘退变的发病机制以及病理生理方面的认识仍较为缺乏。椎间盘退变动物模型在阐明其发病机制以及评估新的治疗方法方面发挥了重要作用,然而,当前还没有理想的椎间盘退变动物模型用以模拟人类椎间盘退变。人类脊柱解剖结构和肌肉系统在经过长期进化后与四足动物形成了巨大差别,作用于脊柱的应力类型和强度均与四足动物不同。人类所特有的直立体位和直立体位下的应力刺激也被认为与脊柱相关疾病的高发生率相关。本研究以兔为研究对象,通过无创性脊柱轴向加压的方法建立一种新型椎间盘退变体内动物模型。这种造模方式能够更好的模拟人类椎间盘早期退变的自然进程,从而为椎间盘退变研究提供更加合理的动物模型。在此基础上,通过对该模型退变进程的长时间实验观察,从分子生物学和病理学方面深入探索椎间盘退变的相关机理。第一部分无创性轴向积累性载荷建立兔腰椎间盘退变动物模型目的:通过直立体位下无创性轴向加载的方式,建立一种新型兔腰椎间盘退变的动物模型,使之更好的模拟人类腰椎间盘退变。方法:24只新西兰大白兔随机分为实验组及对照组,每组12只动物。将实验组动物置于特制的透明塑料桶内使之保持直立体位,并通过特制的颈圈使之负重600g,每日实验干预时间为6h。对照组动物不接受任何处理而常规饲养。通过特制装置测量实验组动物在筒内直立体位时与筒壁间的摩擦力。在实验开始前及实验开始后4周、8周12周对全部动物行X线及核磁共振(MRI)检查,观察实验组动物在筒内时腰椎的骨性结构,比较2组动物腰椎间隙高度改变以及髓核含水量变化。实验干预12周后实验组动物不再接受载荷刺激,同对照组一样常规饲养2周,以恢复因压力导致的椎间盘水合改变,14周时行末次MRI检查。而后实验组及对照组全部动物处死,取L4-5节段椎间盘髓核标本,通过realtime-PCR检测细胞外基质基因I型胶原、II型胶原及蛋白多糖表达水平;取L6-7节段椎间盘行正中矢状面病理切片,通过HE及天狼星红染色观察各组动物椎间盘内组织病理学改变。结果:2只实验组动物分别在实验进行至3周及7周时死亡,其相应的实验数据从结果中剔除。实验组剩余的10只动物对实验处理耐受良好。实验组动物与筒壁间相对摩擦力测量显示,开始时摩擦力占体重的19%,随时间逐渐下降,到20min时,摩擦力降至11.1%,在此后的40min测量时间内均在该水平波动。腰椎X线片显示实验组动物在直立体位负重条件下腰椎形成明显后凸,较侧卧体位下腰椎间隙明显变窄。在L2-3节段,直立体位下DHI为侧卧位时的74.4%;在L4-5节段为60.7%;在L6-7节段为46.5%。各节段间DHI改变幅度也存在统计学差异(P0.05)。椎间盘高度指数(disc height index,DHI)测量显示2组动物腰椎各节段DHI随时间逐渐变小,但2组间在任何时间点均无显著差异。MRI检查显示,实验组与对照组髓核相对灰度值均随时间进行性下降;在L2-3节段,实验组与对照组髓核灰度值在任何时间点均无统计学差异;在L4-5节段,2组间髓核灰度值在12周时具有统计学差异,在2周的恢复期后,2组间仍然具有统计学差异(P0.05);在L6-7节段,2组间髓核灰度值在8周时即开始有显著性差异,并持续至实验结束(P0.05)。髓核组织细胞外基质相关基因表达检测显示,实验组I型胶原m RNA表达明显高于对照组(3.57倍,P0.05);而II型胶原及蛋白多糖表达明显低于对照组(分别为0.35倍和0.43倍,P0.05)。病理学检查发现对照组与实验组椎间盘组织结构存在显著差异:对照组HE染色显示髓核组织与纤维环间边界清晰,髓核内富含均匀分布的髓核细胞;天狼星红染色显示纤维环结构完整无损坏,纤维环与髓核间界限清晰,在髓核区域无明显胶原纤维长入。实验组HE染色显示内层纤维环明显增生,而髓核区域相应减小,增生的大量纤维环样组织源于软骨终板,呈纤维软骨样外观;而外层纤维环则丧失了其完整的层状结构;天狼星红染色显示实验组新生的双折光胶原纤维起自软骨终板,侵入髓核组织内,增厚的后纤维环丧失了纤维环的正常层状结构,表现出杂乱的组织结构。正中矢状位切面上“功能性”髓核及纤维环宽度测量结果表明,实验组前纤维环与后纤维环宽度较对照组分别增加了26.5%和37.6%;而髓核宽度较对照组减少14.5%。各组间比较均有显著性差异(P0.05)。结论:本研究中直立体位下无创性轴向加载方式可显著加速兔腰椎间盘的退变进程,表现为实验组动物中、下段腰椎MRI影像中髓核含水量较对照组降低;实验组I型胶原表达升高,而II性胶原及蛋白多糖较对照组表达降低;实验组髓核组织内大量纤维软骨样组织长入,纤维环增厚,而髓核区域较对照组变小,均为典型的椎间盘退变早期征象。本研究建立的兔椎间盘退变模型在发病机理上与人类椎间盘退变更加相似,有望为该领域的研究提供更为合理的动物模型。第二部分积累性轴向载荷致兔腰椎间盘退变的过程观察及机制探索目的:以轴向应力致兔腰椎间盘退变体内模型为研究对象,探索长期轴向载荷刺激下椎间盘退变的病理过程以及相关机制。方法:20只4月龄新西兰兔随机分为实验组(n=12)和对照组(n=8),实验组动物按照第一部分直立体位下轴向载荷体内造模方法建立兔腰椎间盘退变模型,8只对照组动物同期常规饲养,另设4只24月老龄兔同期饲养用于与年龄相关性退变比较。于造模前及造模开始后6周、12周及24周行MRI检查,观察各组椎间盘水合状态,分析椎间盘退变进程。实验组与对照组分别于造模后12周及24周取材,老龄组于24周后取材,对L5-6节段髓核组织行real-time PCR检测,比较各组动物髓核组织基质基因I型胶原、II型胶原、蛋白多糖以及合成/分解代谢相关基因BMP-7、MMP-3、TIMP-1的表达水平;对取材标本L6-7节段行正中矢状位组织病理学切片,HE、天狼星红染色观察退变椎间盘的病理学改变。综合评估长期积累性轴向载荷导致椎间盘退变过程中发生的组织结构以及分子生物学改变。结果:3只实验组动物分别在实验进行至6周、9周及20周时死亡,其相应的实验数据从结果中剔除。实验组剩余的9只动物对实验处理耐受良好。MRI结果显示在上腰椎(L2-3节段),实验组与对照组动物腰椎髓核组织信号强度在24周观察期内均未见显著改变,仍保持较高的含水量。在中段腰椎及下腰椎(L4-5及L6-7节段),对照组24周观察期内仍未见显著信号改变;而实验组从12周即可见明显信号减低,24周时改变更为明显。老龄组上、中、下段腰椎间盘信号均较低,24周后信号改变不明显。Realtime-PCR结果显示实验组髓核组织I型胶原m RNA表达较对照组和老龄组明显增加,而II型胶原及蛋白多糖表达较对照组和老龄组明显减少;实验组合成代谢相关基因BMP-7及分解代谢相关基因MMP-3表达较对照组和老龄组均明显升高,而组织金属蛋白酶抑制因子TIMP-1表达较对照组和老龄组明显降低。与对照组相比,实验组12周病理结果显示纤维软骨样组织自终板长入髓核组织,后纤维环增厚,髓核区域被分隔;24周时上述病理改变更为明显,长入髓核组织内的纤维软骨样组织已分化为成熟纤维环结构,髓核组织区域进一步减少;30月龄兔椎间盘病理改变表现为整个髓核组织发生纤维化,髓核区域内无明显胶冻样组织结构,但纤维环排列则较为规整。髓核脊索细胞CK18免疫组化染色显示对照组髓核组织内广泛分布成簇存在的脊索细胞,而实验组髓核内脊索细胞特异性抗原CK18阳性表达细胞簇较对照组明显减少,髓核组织中央区域出现较多的单个存在的小软骨细胞样髓核细胞,而外周区域髓核组织则被上下软骨终板发出的纤维软骨样组织取代。结论:本研究采用的轴向载荷的长期作用可使兔腰椎间盘发生进行性退变,尤其在下腰椎,实验组24周载荷作用后,其腰椎间盘水合状态与30月龄老龄兔相应节段相当。髓核基质成分基因表达水平随年龄变化较小,但对机械载荷刺激非常敏感。腰椎在高载荷作用下,其髓核内合成及分解代谢均较为活跃,这可能是椎间盘内组织细胞结构改变的分子生物学基础。长期轴向载荷作用会导致腰椎上、下软骨终板产生大量纤维软骨样组织长入髓核,将髓核组织分隔并逐步取代,形成成熟的纤维环样结构,然而后纤维环自身完整的层状结构丧失,并有髓核组织渗入后纤维环外层,成为椎间盘突出的病理基础;老龄组椎间盘内胶冻状髓核组织亦显著变小,但纤维环的层状结构正常。轴向载荷刺激可导致髓核内脊索细胞特异性抗原CK18阳性表达细胞簇较对照组明显减少,髓核组织中央区域出现较多的单个存在的小软骨细胞样髓核细胞,而外周区域髓核组织则被上下软骨终板发出的纤维软骨样组织取代,这些改变可能是人类以及某些脊椎动物随着年龄增长,髓核内脊索细胞逐渐减少甚至消失的病理基础。
【图文】：

摩擦力,体重,测量点,动物

但两组间体重在任何时间点均无显著性差异（P>0.05）。图1-4 实验组动物与筒壁间摩擦力动态变化。摩擦力（f）标准化于实验动物自身体重，表示为 f%=（W1-W2）/W1。在一小时的监测时间内，f%最高为 19.0%（t=0），最低为 8.5%（t=30min），在 20min 时为 11.1%，，此后在此水平波动。

实验组,后侧,对照组,动物实验

图 1-6 显示实验组（a）以及对照组（b）动物实周后侧卧位 X 线片。DHI 测量显示实验组及对照组 DH无论在任何时间点以及任何节段，实验组与对照组间
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R-332;R681.53

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