结核分枝杆菌分泌性效应分子的鉴定、功能与信号传递研究

发布时间：2019-10-30 17:34

【摘要】：由结核分枝杆菌感染导致的结核病仍然是世界上最致命的传染性疾病之一。全球约有三分之一的人口潜伏感染结核病。在2013年,全球大约有900万人患结核病,其中中国患者约占总比例数的11%；另外还有150万结核病患者死亡,其中36万人为结核病和艾滋病毒共感染患者。据统计,在2013年,全球约有48万人患耐多药结核病,其中约有9.0%的耐多药结核病患者罹患广泛耐药结核病。这些触目惊心的数字表明结核分枝杆菌是人类最难对付的致病菌之一。结核分枝杆菌之所以有如此大的破坏力,是因为其在宿主巨噬细胞内成功的生存策略,而这主要归功于该菌释放的效应分子(或毒力因子)。结核分枝杆菌的效应分子包含各类脂质和分泌蛋白。目前鉴定出来的效应分子主要分为三类：(1)能增强结核分枝杆菌抵抗宿主产生的杀菌复合物,如KatG、SodC和AhpC；(2)能阻断吞噬体成熟过程,如PtpA.PknG和SapM；(3)能抑制宿主细胞的凋亡,如NuoG和SodA。但这些效应分子还无法完全解析结核分枝杆菌的致病性；因此,鉴定和研究新的效应分子仍是当前工作的重点和难点。基于以上现状,本论文主要从以下几个方面进行研究。首先,本文介绍了一种综合性的新型生物信息学方法预测参与宿主-病原菌相互作用的结核分枝杆菌关键性分泌蛋白。我们利用聚类分析方法按以下标准尽可能多地收集已有的文献数据：(a)攻击巨噬细胞后结核分枝杆菌的基因表达和DNA芯片数据；(b)利用全基因组插入诱变技术鉴定不同条件下基因的必需性数据；(c)攻击动物模型后结核分枝杆菌基因表达数据；(d)结核病患者体内结核分枝杆菌基因表达数据；(e)结核分枝杆菌临床菌株丢失的基因数据；(f)蛋白质亚细胞定位数据；(g)结核分枝杆菌与宿主及宿主肠道菌群蛋白质组的非同源性分析数据。然后按照不同标准进行全基因组计分、排序将不同数据集的数据整合起来。接着我们预测到结核分枝杆菌中54个潜在的与宿主相互作用的关键性分泌蛋白。这些蛋白质符合以下特征：在结核分枝杆菌感染过程中上调表达,结核分枝杆菌胞内存活而非胞外存活所必须,在临床菌株中保守存在,定位于细菌胞外,与宿主及宿主肠道菌群蛋白质组没有同源物。最后我们探讨了这些分泌蛋白进一步深入研究的可能性和重要性,为抗结核药物的开发提供了可供选择的平台。接着,我们选择一个可能的分泌蛋白Rv3402c进行了深入细致的分子生物学与细胞生物学方面的研究,本文重点研究了Rv3402c与宿主巨噬细胞之间的相互作用。首先我们构建了能够表达Rv3402c蛋白的重组耻垢分枝杆菌(简写为MS_Rv3402c)和空载体重组耻垢分枝杆菌(简写为MS_Vec)。利用蛋白酶敏感性分析实验和Western blot首次实验证实了Rv3402c蛋白是一个分泌蛋白。接着发现重组菌MS_Rv3402c在巨噬细胞中的存活率显著增加,且该重组菌能诱导巨噬细胞的裂解死亡。重组菌MS_Rv3402c和对照菌MS_Vec在无菌培养基中显示出相同的生长速率,而且各自的抗压能力也不相上下,这暗示MS_Rv3402c胞内存活能力的增强可能是Rv3402c蛋白干扰宿主细胞先天免疫应答的结果。ELISA以及半定量RT-PCR实验结果显示,MS_Rv3402c刺激巨噬细胞产生促炎性因子TNF-α和IL-1β的能力明显高于MS_Vec。我们利用纯化的Rv3402c蛋白也佐证了这些细胞因子是特异性地由该蛋白介导产生的。通过信号通路抑制剂实验,我们发现NF-κB, ERK1/2和p38信号途径对于Rv3402c诱导的TNF-α分泌是必需的。不过只有NF-κB和ERK1/2信号通路是Rv3402c诱导的IL-1β分泌所需的,而p38途径对其分泌没有影响。这说明Rv3402c刺激这两种细胞因子分泌的信号途径可能存在差异。以上结果揭示Rv3402c可能通过干扰宿主的信号途径来扰乱宿主的免疫应答,最终导致细菌的胞内存活率提高以及巨噬细胞的加速裂解死亡。最后,本文研究了结核分枝杆菌中著名的分泌性效应分子PtpA(蛋白酪氨酸磷酸酶A)的调控蛋白PtkA(蛋白酪氨酸激酶A)的一些重要功能。序列比对结果显示,PtkA最开始被认为是卤酸脱卤酶超家族的一员。不过通过生物化学方法分析其酶活性后发现该蛋白是一个蛋白酪氨酸激酶,且能磷酸化PtpA并调控其磷酸酶酶活性。我们首先联合体外蛋白激酶实验和放射性双向电泳技术鉴定PtkA的底物,意外地发现了PtkA的上游调控蛋白,该蛋白能够抑制PtkA的激酶活性。虽然目前还不能确定是哪个蛋白发挥抑制作用,但我们推测这极有可能是至今仍未见报道PtkA其它底物的主要原因。实验过程中,我们优化了实验室现有的重组PtkA蛋白及体外蛋白激酶实验条件,然后利用生物信息学方法预测到8个潜在的酪氨酸磷酸化蛋白质。通过一系列生物化学方法体外证明了TrxB2是PtkA在结核分枝杆菌中除自身及PtpA以外的第三个蛋白酪氨酸激酶底物,其磷酸化残基为32位的酪氨酸。根据序列比对信息发现,结核分枝杆菌的TrxB2和恶臭假单胞菌(P.putida)中的同源蛋白TrxB2的磷酸化酪氨酸残基是相同位置,且磷酸化酪氨酸残基附近的氨基酸同源性也相当高。该结果从而也验证了细菌之间磷酸化位点的保守性。通过酶活分析以及western blot等试验发现PtkA对TrxB2的磷酸化作用不影响后者的酶活性,但能抑制TrxB2的分泌；也就是说结核分枝杆菌H37Rv ΔptkA突变株分泌了更多的TrxB2到细菌细胞外。本实验室未发表的反向遗传学数据显示,体外培养的结核分枝杆菌H37Rv AptkA突变株比野生株更加耐受H202和氢过氧化枯烯。鉴于TrxB2是一个硫氧还蛋白还原酶,文献报道它能中和氧化压力。因此,我们的实验结果可以解释这一现象：结核分枝杆菌H37Rv ΔptkA突变株分泌了更多的TrxB2到细胞外,TrxB2独自或与TrxC共同对H202和氢过氧化枯烯进行了中和解毒作用,从而使该突变株更加耐受这些氧化压力。但是这一过程对于结核分枝杆菌自身的代谢或生存的意义还有待进一步研究。总之,本文预测了一批潜在的抗结核药物靶点,确定了Rv3402c作为结核分枝杆菌效应蛋白的事实并拓展了人们对结核分枝杆菌分泌蛋白调控网络的认识。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.911

【参考文献】