痤疮合剂对皮脂腺分泌及兔耳痤疮模型炎症相关信号通路影响的研究

发布时间：2019-11-08 21:07

【摘要】：一目的:本研究通过体内实验,旨在探讨金黄地鼠皮脂腺及血清性激素在痤疮发生机制中的作用,研究痤疮合剂对金黄地鼠皮脂腺重叠叶数、皮脂腺斑面积大小及血清睾酮、雌二醇的影响,对痤疮合剂治疗寻常痤疮的机理进行初步探索,为临床应用提供实验依据。材料与方法:采用金黄地鼠腹部皮脂腺斑作为研究对象,痤疮合剂为干预因素,清热暗疮胶囊为阳性对照药,以金黄地鼠腹部皮脂腺斑、血清睾酮、雌二醇水平为效应指标进行体内试验。将金黄地鼠随机分为模型对照组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、清热暗疮胶囊组,模型对照组以2ml生理盐水灌胃,中药高中低剂量组以不同比例浓缩的痤疮合剂2ml灌胃,清热暗疮胶囊组予稀释的清热暗疮胶囊2ml灌胃,每日一次,于实验第14天取材,用摘除眼球法采血3-5ml,采血后脱颈椎处死动物,在强光照射下,用游标卡尺分别测量左右侧斑块的最大横径和最大纵径,然后立即取下金黄地鼠侧腹部皮脂腺斑组织,固定并染色,于显微镜下观察皮脂腺斑的重叠叶数,ELISA法检测血清中睾酮、雌二醇水平。结果:1.皮脂腺显微结构下重叠叶数:与模型对照组比较,中药高、中、低剂量组、清热暗疮胶囊组皮脂腺重叠叶数显著减少,差异具有统计学意义(P0.01);与清热暗疮胶囊组比较,中药高、中、低剂量组的皮脂腺重叠叶数无明显差异(P0.05)。2.皮脂腺斑面积大小:用药前各组皮脂腺斑大小无显著性差异(P0.05)。用药后,与模型对照组比较,中药高、中、低剂量组两侧皮脂腺斑面积明显减小,差异具有统计学意义(P0.01);与清热暗疮胶囊组比较,中药中、低剂量组显著增大,差异具有统计学意义(P0.05、P0.01),而中药高剂量组与其相比显著减小,差异具有统计学意义(P0.05)。3.睾酮水平:与模型对照组比较,中药高、中、低剂量组、清热暗疮胶囊组睾酮水平显著下调,差异具有统计学意义(P0.01);与清热暗疮胶囊组比较,中药中、低剂量组的睾酮水平上调,差异具有统计学意义(P0.01),而中药高剂量组与其相比显著下调,差异具有统计学意义(P0.05)。4.雌二醇水平:与模型对照组比较,中药高、中剂量组、清热暗疮胶囊组雌二醇水平显著上调,差异具有统计学意义(P0.01),中药低剂量组雌二醇上调,差异有统计学意义(P0.05);与清热暗疮胶囊组比较,中药中、低剂量组的雌二醇水平下调,差异具有统计学意义(P0.01),中药高剂量组与其相比显著上调,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:1.痤疮合剂通过抑制皮脂腺细胞的增生和分泌功能,进而使皮脂腺斑缩小,从而达到治疗痤疮的作用。2.痤疮合剂通过降低金黄地鼠血清中的睾酮水平,增加雌二醇水平,进而使皮脂腺分泌、增生功能减退。3.痤疮合剂抑制皮脂腺增生和分泌的功能随着给药剂量的增加逐渐加强,呈良好的量效关系。二目的:研究以兔耳痤疮模型为研究对象,以ERK、NF-κB、p38MAPK、AhR/ARNT信号通路调控为研究中心,利用现代生物学实验技术,分别测定ERK、NF-κB、p38MAPK信号通路及其调控下的TNF-α、IL-6、IL-8蛋白表达水平,Ah R/ARNT及其直接调控下的CYP1A1、GSTA1蛋白表达水平,探索在痤疮发病过程中相关信号通路在其中的作用,从而全面探讨并揭示痤疮合剂在调控ERK、NF-κB、p38MAPK、Ah R/ARNT信号通路的多个环节中的作用机制,为中药安全有效治疗痤疮提供实验依据,为后期临床研究奠定理论基础。材料与方法:采用外涂煤焦油的方法建立兔耳痤疮模型,分别在家兔双耳内侧面耳管开口处2cm×2cm范围,每日用玻璃棒涂煤焦油1次,每次约0.5ml,连续2周。造模第14天取耳部痤疮病变皮肤活检,用10%的甲醛固定然后进行石蜡蜡块包埋再切片,每个标本需要连续切片4张并以HE染色,然后切片并烘干,其后在显微镜下观察,确定造模成功后,进行后续实验。痤疮合剂为干预因素,清热暗疮胶囊为阳性对照药物,以p38MAPK、NF-κB、Ah R/ARNT信号传导通路中相关蛋白表达为效应指标进行体内实验。将48只家兔随机分成6组,即空白对照组、模型对照组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、清热暗疮胶囊组,模型对照组予20ml生理盐水灌胃,中药高中低剂量组以不同比例浓缩的痤疮合剂20ml灌胃,清热暗疮胶囊组予稀释的清热暗疮胶囊20ml灌胃,每日一次,连续治疗14天后全部处死,取耳部皮肤组织观察以下指标:免疫组化法检测TNFR1、TNF-α、IL-6、IL-8、ERK、NF-κB、p38MAPK蛋白表达,Western blot法检测Ah R、CYP1A1、GSTA1蛋白表达。结果:1.造模14天后肉眼可见兔耳表面粗糙、增厚、有粉刺样皮损;组织病理改变可见角化过度,表皮及毛囊上皮的颗粒层、棘层仍增生明显,毛囊口及漏斗部仍见角化物质堆积,漏斗部扩大如壶状,真皮内仍见较多的炎性细胞浸润。2.免疫组化法检测结果:2.1 TNFR1蛋白表达检测结果:空白对照组TNFR1蛋白的平均光密度值为阴性,模型对照组TNFR1蛋白的平均光密度值表达为强阳性。免疫组化平均光密度值测定结果:与空白对照组比较,模型对照组TNFR1平均光密度值显著增高,差异具有统计学意义(P0.01);与模型对照组比较,中药高、中、低剂量组TNFR1平均光密度值显著降低,差异具有统计学意义(P0.01);与清热暗疮胶囊组比较,中药中、低剂量组的TNFR1平均光密度值增高,差异具有统计学意义(P0.05、P0.01),而中药高剂量组TNFR1平均光密度值则降低,差异具有统计学意义(P0.01)。2.2 TNF-α蛋白表达检测结果:空白对照组TNF-α蛋白的平均光密度值为阴性,模型对照组TNF-α蛋白的平均光密度值表达为强阳性。免疫组化平均光密度值测定结果:与空白对照组比较,模型对照组TNF-α平均光密度值显著上调,差异具有统计学意义(P0.01);与模型对照组比较,中药高、中剂量组TNF-α平均光密度值显著下调,差异具有统计学意义(P0.01),中药低剂量组TNF-α平均光密度值显著下调,差异具有统计学意义(P0.05);与清热暗疮胶囊组比较,中药中、低剂量组的TNF-α平均光密度值上调,差异具有统计学意义(P0.01),而中药高剂量组与清热暗疮胶囊组相比差异无统计学意义。2.3 IL-6蛋白表达检测结果:空白对照组IL-6蛋白的平均光密度值为阴性,模型对照组IL-6蛋白的平均光密度值表达为强阳性。免疫组化平均光密度值测定结果:与空白对照组比较,模型对照组IL-6平均光密度值显著增高,差异具有统计学意义(P0.01);与模型对照组比较,中药高、中、低剂量组IL-6平均光密度值显著降低,差异具有统计学意义(P0.01);与清热暗疮胶囊组比较,中药中、低剂量组的IL-6平均光密度值增高,差异具有统计学意义(P0.01),而中药高剂量组IL-6平均光密度值则降低,差异具有统计学意义(P0.05)。2.4 IL-8蛋白表达检测结果:空白对照组IL-8蛋白的平均光密度值为阴性,模型对照组IL-8蛋白的平均光密度值表达为强阳性。免疫组化平均光密度值测定结果:与空白对照组比较,模型对照组IL-8平均光密度值显著增高,差异具有统计学意义(P0.01);与模型对照组比较,中药高、中、低剂量组IL-8平均光密度值显著降低,差异具有统计学意义(P0.01);与清热暗疮胶囊组比较,中药中、低剂量组的IL-8平均光密度值增高,差异具有统计学意义(P0.05、P0.01),而中药高剂量组与清热暗疮胶囊组相比则明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。2.5 ERK蛋白表达检测结果:空白对照组ERK蛋白的平均光密度值为阴性,模型对照组ERK蛋白的平均光密度值表达为强阳性。免疫组化平均光密度值测定结果:与空白对照组比较,模型对照组ERK平均光密度值显著增高,差异具有统计学意义(P0.01);与模型对照组比较,中药高、中剂量组ERK平均光密度值显著降低,差异具有统计学意义(P0.01),而中药低剂量组与其相比不具有统计学意义;与清热暗疮胶囊组比较,中药中、低剂量组的ERK平均光密度值增高,差异具有统计学意义(P0.01),而中药高剂量组ERK平均光密度值则降低,差异具有统计学意义(P0.05)。2.6 NF-κB蛋白表达检测结果:空白对照组NF-κB蛋白的平均光密度值为阴性,模型对照组NFκB蛋白的平均光密度值表达为强阳性。免疫组化平均光密度值测定结果:与空白对照组比较,模型对照组NF-κB平均光密度值显著增高,差异具有统计学意义(P0.01);与模型对照组比较,中药高、中剂量组NFκB平均光密度值显著降低,差异具有统计学意义(P0.01),中药低剂量组NF-κB水平平均光密度值降低,差异具有统计学意义(P0.05);与清热暗疮胶囊组比较,中药中、低剂量组的NF-κB平均光密度值增高,差异具有统计学意义(P0.01),而中药高剂量组NF-κB平均光密度值则降低,差异具有统计学意义(P0.05)。2.7 p38MAPK蛋白表达检测结果:空白对照组p38MAPK蛋白的平均光密度值为阴性,模型对照组p38MAPK蛋白的平均光密度值表达为强阳性。免疫组化平均光密度值测定结果:与空白对照组比较,模型对照组p38MAPK平均光密度值显著增高,差异具有统计学意义(P0.01);与模型对照组比较,中药高、中、低剂量组p38MAPK平均光密度值显著降低,差异具有统计学意义(P0.01);与清热暗疮胶囊组比较,中药低剂量组的p38MAPK平均光密度值增高,差异具有统计学意义(P0.01),中药中剂量组与其相比差异不具有统计学意义,中药高剂量组p38MAPK平均光密度值与其相比显著降低,差异具有统计学意义(P0.05)。3.Western blot法检测结果:3.1 Ah R蛋白水平:与空白对照组比较,模型对照组Ah R水平显著上调,差异具有统计学意义(P0.01);与模型对照组比较,中药高、中、低剂量组Ah R表达水平显著下调,差异具有统计学意义(P0.01);与清热暗疮胶囊组比较,中药中、低剂量组的Ah R的表达水平上调,差异具有统计学意义(P0.01),而中药高剂量组Ah R表达水平则下调,差异具有统计学意义(P0.05)。3.2 CYP1A1蛋白水平:与空白对照组比较,模型对照组CYP1A1水平显著上调,差异具有统计学意义(P0.01);与模型对照组比较,中药高、中、低剂量组CYP1A1表达水平显著下调,差异具有统计学意义(P0.01);与清热暗疮胶囊组比较,中药中、低剂量组的CYP1A1表达水平上调,差异具有统计学意义(P0.01),而中药高剂量组与清热暗疮胶囊组相比CYP1A1显著下调,差异有统计学意义(P0.05)。3.3 GSTA1蛋白水平:与空白对照组比较,模型对照组GSTA1水平显著上调,差异具有统计学意义(P0.01);与模型对照组比较,中药高、中、低剂量组GSTA1表达水平显著下调,差异具有统计学意义(P0.01);中药中、低剂量组GSTA1表达水平显著上调,差异有统计学意义(P0.05、P0.01),而中药高剂量组与清热暗疮胶囊组比较GSTA1表达水平显著下调,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:1.痤疮合剂能下调血清TNF-α、IL-8、IL-6炎症因子蛋白水平表达,抑制痤疮炎症发展。2.痤疮合剂能下调p38MAPK、ERK及NF-κB蛋白表达水平,干扰信号p38MAPK、ERK及NF-κB信号通路。3.血清炎症因子受p38MAPK、ERK及NF-κB信号通路的调控,痤疮合剂治疗痤疮的途径之一是通过降低炎症因子水平,抑制p38MAPK、ERK及NF-κB信号通路。4.痤疮合剂可以干扰AhR/ARNT信号通路及其直接调控下的CYP1A1、GSTA1水平,调节内分泌水平,干扰痤疮的发展进程。5.痤疮合剂下调血清炎症因子、调控p38MAPK、ERK、NF-κB及Ah R/ARNT信号通路的功能随着给药剂量的增加逐渐加强,呈良好的量效关系。
【图文】：

2各组金黄地鼠用药前后皮脂腺斑面积比较

模型对照组病理学观察（HE染色,×40）
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R285.5;R-332

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本文编号：2558043