MiR-214与腺苷A2A受体相互调控的分子机制及其在炎症反应中的作用研究

发布时间：2019-11-13 08:55

【摘要】：炎症(inflammation)是具有血管系统的机体对损伤因子所发生的一系列复杂的防御反应,具有杀灭病原体、限制感染及修复损伤等作用,是损伤、抗损伤和修复三为一体的统一过程。炎症是伴随多种疾病状态下一种共有的复杂的病理现象,体表的外伤感染和各器官的大部分常见病和多发病(如肺炎、肝炎、肾炎等)都属于炎症性疾病。炎症的发生、发展和转归取决于体内各种促炎因素及抗炎因素在不同的环节、时相和过程相互作用和博弈时形成的复杂而又精细的调控网络是否平衡。微小RNA(micro RNA,mi RNA)已被证实在炎症反应中发挥重要的调节作用。和其他分子类似,miRNA也有抑炎和促炎之分。其中的miR-214,目前研究提示主要发挥促炎作用,其机制为延缓单核细胞的凋亡及维持T细胞的活化,但miR-214能否通过直接抑制某些抑炎基因的表达来实现促炎尚无文献报道。近年的研究表明,腺苷A2A受体(A2AR)活化后在外周组织通过抑制促炎细胞因子的产生和释放、中性粒细胞浸润等在多种器官组织损伤和炎症模型(如缺血性肝损伤、急性肺损伤、缺血再灌注损伤及急性肾损伤模型)中发挥显著的抑制炎症保护作用,但A2AR的蛋白表达水平却在上述模型中表达下调,这无疑制约了A2AR激动剂的应用。目前对A2AR自身表达调控对其抑炎作用的影响尚不清楚。鉴于mi R-214和A2AR在炎症中均具有重要作用,那么A2AR的表达是否受到mi R-214的调控?mi RNA的加工和合成同样受到其他分子的调控,A2AR的抑炎效应是否包括抑制miR-214的表达?以上目前均未有相关报道。为了明确mi R-214与A2AR之间在炎症中相互表达调控的作用机制及在炎症中的作用:在本课题中,我们首先使用生物信息学预测,筛选出mi R-214为研究对象,在小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞中,借助miR-214 mimic观察对A2AR蛋白和mRNA表达的影响,然后利用报告基因分析解析A2AR基因3'端非编码区(3'-UTR)与mi R-214的结合位点。然后,我们猜测A2AR反过来也可能调控mi R-214的表达,使用A2AR的激动剂CGS21680和拮抗剂ZM241385、PKA抑制剂H89和NF-κB抑制剂BAY 11-7082处理小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)和RAW264.7细胞,观察对mi R-214表达的影响,探讨了可能涉及的主要信号通路。最后,在bmdms中过表达mir-214检测对炎症因子tnf-α和il-6表达的影响,借助脂多糖(lps)诱导的小鼠急性肺损伤(ali)模型,观察a2ar蛋白和mir-214的表达相关性以及联合应用a2ar激动剂和mir-214抑制剂对小鼠ali模型伤情的影响。主要取得了以下研究结果:1.利用targetscan、miranda和mirmap生物信息学在线软件预测可能调控a2ar的mirna,发现在3'-utr有mir-214潜在的结合位点;在raw264.7细胞中,借助mir-214mimic过表达mir-214,westernblot和real-timepcr证实,mir-214可以在蛋白水平而不是mrna水平抑制a2ar的表达;构建含a2ar3'-utr的报告基因载体,使用双荧光素酶报告基因检测结合定点突变,详细解析了a2ar3'-utr与mir-214结合的精确位点;进行功能回复实验,向转染了mimic的细胞中同时转染不含3'-utr的a2ar真核表达质粒,进一步确定mir-214是通过与a2ar3'-utr的特异性结合来调控其表达。以上结果提示a2ar是mir-214的另一靶基因。2.生物信息学预测在mir-214启动子区-1000~+200存在两个转录因子nf-κb可能的结合位点;据此构建了包含不同长度的mir-214启动子区luc报告基因载体并结合定点突变,luc报告基因检测显示nf-κb的激活能够促进mir-214启动子的转录活性;结合染色质免疫沉淀(chip)实验证实nf-κb的p65亚基特异性的与mir-214启动子区-490~-481和-27~-16结合。在raw264.7细胞中,借助a2ar激动剂和拮抗剂,pka和nf-κb抑制剂,经westernblot检测,a2ar活化后通过pka途径抑制iκbα的磷酸化进而抑制nf-κbp65亚基的核转位从而抑制nf-κb通路;在bmdms和raw264.7中证实激活a2ar后通过pka-nf-κb途径下调mir-214表达,经emsa和chip-qpcr证实可能的机制是a2ar的活化使nf-κbp65的核转位受到抑制,减弱其与mir-214启动子区的结合从而降低了转录活性。以上结果阐明了a2ar下调mir-214表达的分子机制,综合1中结果,初步提示在细胞炎症模型中存在mir-214/a2ar负反馈调控环路。3.通过在bmdms中转染mir-214agomir和lps处理,构建了mir-214过表达的细胞炎症模型,借助real-timepcr和elisa方法检测mir-214过表达促进了tnf-α和il-6的表达;成功构建lps诱导的ali模型,观察到此炎症模型中mir-214的表达显著上调,而a2ar蛋白的表达水平显著降低,二者呈负相关关系;在此模型中联合应用a2ar激动剂及mir-214antagomir治疗损伤小鼠,通过he染色、免疫组织化学和real-timepcr的方法证实联合应用治疗效果优于单独作用。通过上述细胞及动物实验证实:miR-214具有促炎作用,综合使用激活A2AR和抑制mi R-214表达的方法更有益于控制炎症反应。以上的研究成果表明,mi R-214/A2AR负反馈调控环路在炎症模型中具有促炎作用:炎症及损伤中,炎性细胞中miR-214表达上调,在转录后水平抑制A2AR的表达;A2AR表达下降减弱了其通过PKA对NF-κB的抑制,即A2AR的抑炎作用减弱;反之,对NF-κB抑制的减弱促进其进一步上调mi R-214表达,从而放大了炎症反应。我们的发现阐明了mi R-214与A2AR相互表达调控的分子机制,而且可以为下一步以mi R-214及A2AR为调节靶点来治疗炎症性疾病新策略的设计与实施提供理论依据。
【图文】：

质粒图谱,萤光素酶,博士学位论文,生物技术

第三军医大学博士学位论文(2)PCR 引物由上海英骏生物技术有限公司合成。2.1.1.4 质粒(1)miRNA 双萤光素酶报告基因载体 pmirGLO(Dual-Luciferase miRNA ession Vector)购于美国 Promega 公司。

MiR-214与腺苷A2A受体相互调控的分子机制及其在炎症反应中的作用研究

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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R364.5

【参考文献】