人软骨来源多能干细胞的分离鉴定

发布时间：2019-11-21 07:44

【摘要】：干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能干细胞。在一定条件下,它可以分化成多种不同组织及器官的细胞。干细胞存在于发育的不同时期,所表现的干细胞特点,如自我更新及分化能力在各个时期都有所不同。随着年龄的增长,干细胞的潜能有所减少。根据干细胞的发育潜能,干细胞可以分为全能干细胞)(Totipotent stem cells)、多能干细胞(Pluripotent stem cells)、专能干细胞(Multipotent stem cells)及单能干细胞(Unipotent stem cells)。全能干细胞是指受精卵到卵裂期32个细胞前的所有细胞,具有无限分化潜能,能够分化成人体中各个组织器官的细胞,并可以发育成一个完整个体。多能干细胞是一类具有自我更新及自我复制能力的细胞,可以向几乎人体所有类型的细胞分化,但不具有形成完整个体的潜能。专能干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化,如造血干细胞可以向红细胞和白细胞等各类血细胞分化。而单能干细胞只能分化成一种细胞类型。根据干细胞来源,干细胞可分为人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,hESCs)、人成体干细胞(Human adult stem cells,hASCs)及诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)。hESCs来源于囊胚内细胞团,是一种未分化的细胞,受Oct4-Sox2-Nanog转录调控网络调控,具有在体外培养条件下,无限增殖、自我更新及多向分化的特点及发育的全能性,是一种多能干细胞。hESCs细胞形态体积小、核质比高、在显微镜下可见一个或多个核仁,具有稳定的二倍体核型、增殖迅速并表达多种相关抗原:Oct4、Nanog、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、GCTM-2、hTERT、TDGF-1、REX1、UTF-1、Ssea-3、Ssea-4、CD9、CD24和CD133。hESCs在体外及体内均可被诱导分化为人机体中来源于外胚层、中胚层及内胚层的所有细胞类型,但不能独自发育成一个个体。ASCs为组织特异性干细胞,存在于人体相应的各个组织中。ASCs在胎儿时期出现,并贯穿整个生命。出生后在机体组织中含量较少、自我更新的能力有限,可以向同一个组织的不同细胞分化,是专能干细胞,主要功能为维持机体自身机能,为修复或替换受损组织提供细胞来源(如血液及皮肤等)。ASCs表达多种相关抗原:CD90、CD105、CD9、CD61、CD29、CD104、CD44、CD106、CD56、和CD166。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),是发现于骨髓的非造血干细胞。在正常实验室培养条件下,间充质干细胞可贴壁并在显微镜下呈纺锤样生长,因此,它们是属于ASCs一类的多能干细胞。目前,MSCs已从多种组织中分离,获得骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、Wharton's jelly源间充质干细胞、脐带基质间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、羊水膜及羊水间充质干细胞、胰腺间充质干细胞及其他组织来源的间充质干细胞(如皮肤和骨骼肌)。有研究表明MSCs可以从分化一种类型的细胞转化成分化另一种类型的细胞,即“干细胞横向分化”。例如,Razavi S et al成功转化人脂肪间充质干细胞为周围神经系统的类Schwann细胞;Krause DS et al研究证明人骨髓间充质细胞可转化为肝、肺、胃肠道及皮肤上皮细胞。因此,间充质干细胞具有多潜能性,可以诱导分化成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、肝细胞心肌细胞及神经细胞等。iPSCs的概念由日本科学家Yamanaka S et al.在2006年首次提出,使用基因转染技术,通过病毒载体将外源4个多能干细胞转录因子Oct3/4、Sox2、c-Myc及Klf4的组合转入终末分化的人体细胞中,重编程体细胞后获得在细胞形态、生长特性、干细胞标志物、DNA甲基化及基因表达谱等方面与hESCs相似的细胞,并具有无限增殖、多向分化的潜能。上述干细胞都存在各自的优缺点:hESCs在实验室条件下可长期培养并维持自我更新的能力及多潜能性,但其来源有限、具有形成畸胎瘤的潜在能力,以及其临床使用受到伦理限制;hASCs来源广泛,但其增殖能力及分化潜能有限,因此对组织修复能力有限;iPSCs具有多潜能性,来源广泛,但由于肿瘤中也表达部分转染所用转录因子,使iPSCs具备至肿瘤形成及病毒感染的风险。有报道表明,在其他辅助条件下通过缩减所用的转录因子的数量也可形成iPSCs。此外,iPSCs转化率较低,由最初代转化成功率0.01-0.1%到目前的10%左右,有待进一步提高。干细胞被用来治疗多种疾病。其中,造血干细胞移植被人们熟知。外周血造血干细胞移植、脐血造血干细胞移植用来治疗血液系统疾病,如急性白血病、再生障碍性贫血等获得较好疗效。日本学者在临床上使用自体人iPSC来源视网膜色素上皮细胞治疗黄斑部退化,成为使用iPSCs应用于临床治疗的第一例,并获得有效成果,患者表明治疗后,感觉视觉“变亮了”。此后自体或他人来源iPSCs在日本被多次应用于临床治疗退行性疾病。有报道将hESCs分化形成的终末神经细胞应用于退行性神经系统疾病,如帕金森,Huntington病及阿尔兹海默病的治疗,患者病情有所好转。也有hESCs诱导分化形成的胰岛细胞应用于1型糖尿病的治疗、以及分化形成心肌细胞用于修复坏死的心肌的案例。1型糖尿病是以胰岛素绝对缺乏以及高血糖为特点的全身代谢性疾病。长期碳水化合物、脂肪及蛋白等代谢紊乱引起多器官或系统功能障碍,如眼、肾、神经、心脏及血管等慢性病理性改变。临床上,多数1型糖尿病患者通过注射外源胰岛素及均匀摄入碳水化合物来维持血糖,但由于血糖的调控是个非常精密的过程,所以单纯胰岛素注射很难使血糖维持在生理性波动区域范围内。此外,外源胰岛素注射并不能有效预防糖尿病相关大血管及微血管并发症。目前为止,临床上唯一可治愈1型糖尿病的方法为胰岛β-细胞的替代治疗,包括胰腺移植及人胰岛移植,但此方法供体来源有限、手术并发症及终生使用免疫抑制剂等因素制约其发展。其他暂处于研究阶段的胰岛β-细胞的替代治方法包括异种胰岛细胞、基因工程胰岛素分泌细胞及干细胞。然而,现有的干细胞都存在不足,不能满足临床级治疗用干细胞的条件。本课题组一直从事干细胞相关研究,先后从不同胎龄及组织中提取了不同类型的干细胞。且这几类细胞具有相似的生物学特性。本研究中,我们从胎龄8-12周自然流产胎儿的关节软骨中获取了一类多能干细胞,命名为人软骨来源多能干细胞。通过外科手术方法及胰蛋白酶和II型胶原酶二步消化法分离了人软骨来源多能干细胞,使用H-DMEM及knock-out DMEM培养基培养原代和继代细胞,发现第3代细胞及第10代细胞的增殖能力没有明显改变,流式细胞仪分析结果提示,这是一群处于静止期(G0/G1细胞周期)的原始细胞。我们发现,将第3代细胞以1:5传代后第12天左右到底7代时,我们获取了约200亿个细胞,提示此细胞有较强的增殖能力,为干细胞大量扩增提供了实验基础。同时,我们通过流式细胞学检测,发现这群细胞既表达部分人胚胎多能干细胞的生物学标志(OCT4、NANOG、Sox2、Ssea-3和Ssea-4),同时也表达部分成人干细胞的生物学标志(CD29、CD44、CD90、CD105、CD73 和 STRO-1),且不表达移植物抗宿主相关抗原(CD80,CD40及HLA-DR),提示此类干细胞的生物学特性介于胚胎干细胞和成人干细胞并具有低免疫原性。通过RT-PCR检测,我们发现此类干细胞表达hESC相关基因:OCT4、NANOG、TDGF-1及中胚层相关基因TBX5,但不表达hESC相关基因hTERT;或其他胚层相关基因(MEF2C、SOX17、NEUROD及PAX6)。通过向三胚层细胞诱导分化,我们发现在不同诱导条件下,此细胞可以向中胚层的类脂肪细胞、类成骨细胞及类软骨细胞分化;向外胚层的类神经细胞分化;以及向内胚层的胰岛素分泌细胞分化,提示它为可以向三胚层细胞分化的多能干细胞,其分化潜能类似于人胚胎干细胞。综上所述,我们从8-12周胎龄的胎儿关节软骨中获取了一类多能干细胞,此类细胞未见文献报道,命名为人软骨来源多能干细胞,它是较为原始的细胞,具有向三胚层细胞分化的潜能,并可在实验室条件下大量扩增的特点,为干细胞治疗提供了一种新的临床级治疗用干细胞的可能及实验依据。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R329.2

【参考文献】