尿道外括约肌注射α-synuclein纤维体诱导多系统萎缩小鼠模型的构建及机制研究

发布时间：2020-03-28 18:19

【摘要】：背景α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)阳性包涵体在神经系统形成及播散是α-突触核蛋白病共同的核心病理特征~([1])。α-Syn阳性包涵体选择性累及神经系统特定区域导致不同疾病症候群~([2])。多系统萎缩(multiple system atrophy,MSA)是一种散发的进展迅速、预后差的α-突触核蛋白病,神经系统多部位受累,缺乏有效治疗办法。其临床表现为自主神经功能障碍、左旋多巴非敏感性帕金森症状、小脑性共济失调,或三种症状共存。以泌尿生殖功能障碍为主的自主神经障碍是其主要临床表现~([3])。建立MSA的动物模型可以重现MSA的各种临床症状及病理特点,为研究MSA的发病机制、探索MSA的诊断及治疗提供更好的平台。目前MSA动物模型的研究限于神经毒物或转基因模型,仅展现MSA部分病理改变及运动症状,未能很好的模拟MSA的自主神经功能障碍~([4-6])。本研究构建α-Syn阳性包涵体从尿道外括约肌(external urethral sphincter,EUS)神经末梢沿泌尿生殖相关自主神经通路逆行播散至中枢神经系统(central nervous system,CNS)的小鼠模型,模拟MSA的病理改变,进一步诱导MSA类似的自主神经功能障碍及运动障碍。此结果提示:α-Syn阳性包涵体沿泌尿生殖相关自主神经通路逆行播散至CNS可能导致MSA症候群。多系统萎缩是一种致命的多系统神经退行性疾病,其特征在于快速进展性自主神经衰竭,小脑性共济失调和帕金森样症状的可变组合~([7])。目前公认的MSA的病理学特征是在少突胶质细胞中错误折叠的α-Syn聚集形成的包涵体(glial cytoplasmic inclusions,GCIs),以及神经细胞α-Syn包涵体(neuronal inclusions,NIs)~([8])。动物实验研究表明,将MSA病人的脑匀浆注射于TgM83转基因小鼠脑部后,可以诱导小鼠出现MSA类似的病理改变及运动功能障碍,揭示了α-Syn播散理论在MSA等α-突触核蛋白病中的作用机制~([9])。然而,错误折叠的α-Syn播散的起源和及播散途径尚未得到研究阐明。根据最新的指南,泌尿生殖系统功能障碍,直立性低血压和等自主神经功能障碍是诊断MSA所必需的症状。回顾性数据表明,大多数MSA患者在出现运动障碍几年前便可出现自主神经症状,其中以泌尿系统症状多见。此外,锥体外系症状患者的泌尿生殖功能障碍被认为有助于区分早期疾病阶段的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)和MSA~([10])。神经病理学研究表明,MSA患者中枢神经系统中,排尿反射通路存在广泛的退行性改变及α-Syn沉积,包括导水管周围灰质(periaqueductal gray,PAG),蓝斑(locus caeruleus,LC),巴灵顿核(Barrington’s nucleus,BN),中间外侧柱(intermediolateral columns,IML),脊髓Onuf’s核等核团~([11,12]),这可能是导致MSA患者早期出现泌尿生殖功能障碍的原因。迄今为止,MSA等α-突触核蛋白病的发病机制仍不明确,研究者构建了各种动物模型以探索其发病机制和寻找治疗手段,然而这些动物模型均局限于系统毒物模型或转基因动物模型,虽然部分展示了α-突触核蛋白病的神经病理改变及相关运动障碍,但这些模型均不能模拟α-突触核蛋白病的完整发病过程,且几乎没有动物模型模拟MSA类似的自主神经功能障碍~([4])。因此,构建α-突触核蛋白病的动物模型需要新的策略。在这里,我们用转基因小鼠模型来研究MSA的起源和发病机制。我们将预先制备的α-Syn纤维体(preformedα-syn fibrils,α-Syn PFFs)注射于TgM83~(+/-)小鼠的尿道外括约肌,诱导α-Syn阳性包涵体沿泌尿生殖相关自主神经通路逆行播散至CNS,并模拟MSA类似的运动及排尿障碍。本研究提出:“α-Syn阳性包涵体从EUS神经纤维末梢沿泌尿生殖相关自主神经通路逆行播散至大脑导致MSA症候群”的新假说,为揭示MSA的病理机制,寻找阻止MSA的病程进展的特异性分子靶标建立更为优化的动物模型。目的本研究拟通过构建α-Syn阳性包涵体沿泌尿生殖相关自主神经通路逆行播散的MSA小鼠模型,模拟MSA类似的自主神经功能障碍及运动障碍,进一步探讨α-Syn播散在α-突触核蛋白病中的作用机制。方法1.制备并检测α-Syn纤维体。2.将8周龄TgM83杂合子转基因小鼠分为实验组和对照组两组,分别在其EUS注射α-Syn PFFs和磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)。3.于注射前及注射后每2周进行小鼠尿动力检测、肛周肌电图和行为学评价,并于注射后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月处死实验组及对照组小鼠各6只,灌注后取材备用。4.分别对上述造模后时间点的小鼠尿道外括约肌、盆神经节、泌尿相关核团所在的脊髓、脑层面(Onuf’s核,IML,LC,BN,PAG等)进行免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)、免疫荧光双标染色(double immunofluorescence)及蛋白质免疫印迹试验(Western blot,WB),观察α-Syn阳性包涵体在造模后小鼠神经系统中的形成及播散情况。5.进行尿动力、肛周肌电图、行为学相关数据的统计分析。结果1.α-Syn纤维体注射转基因小鼠尿道外括约肌后形成α-Syn阳性包涵体。2.诱导α-Syn阳性包涵体沿泌尿生殖相关自主神经通路逆行播散至CNS,于泌尿相关核团形成α-Syn包涵体,模拟MSA类似的病理改变。3.诱导造模后实验组小鼠出现MSA类似的泌尿障碍及肛周肌电图失神经改变。4.诱导造模后实验组小鼠出现MSA类似的运动功能障碍。结论1.α-Syn纤维体外周注射能在TgM83转基因小鼠中枢神经系统形成阳性包涵体。2.α-Syn阳性包涵体可以从尿道外括约肌神经末梢沿泌尿生殖相关自主神经通路(EUS,Onuf’s核,IML,LC,BN,PAG等)逆行播散至中枢神经系统。3.α-Syn阳性包涵体沿泌尿生殖相关自主神经通路逆行播散小鼠模型可模拟MSA的病理改变,自主神经功能障碍及运动障碍。
【图文】：

纤维体,圆筒状,细丝,比例尺

图 1 电镜下展示 α-Syn 纤维体的圆筒状纤维细丝形态（比例尺：200nm）3.2 免疫组织化学染色检测小鼠泌尿通路 α-Syn 阳性包涵体表达造模后 2 个月内，实验组和对照组小鼠均无异常病理表现。造模后 3 个月，，实验组小鼠尿道外括约肌、盆神经节、泌尿相关核团（脊髓、小脑、脑桥、中脑等）可检测到 α-突触核蛋白阳性包涵体沉积，呈棕褐色颗粒状、斑块状。而对照组小鼠一直到造模后 12 个月仍未检测到相应病理改变（图 2, 3）。

小鼠,免疫组织化学染色,包涵体,实验组

图 2 免疫组织化学染色检测小鼠 EUS、盆神经节 α-Syn 阳性包涵体的表达。A1, 2：实验组小鼠 EUS；A3：对照组小鼠 EUS；B1-4：实验组小鼠盆神经节。（A1-3 左 x 10；A1-3 右x 40；B1-4 左 x 20；B1-4 右 x 40）图 3 免疫组织化学染色显示实验组小鼠脊髓中间外侧柱，脑桥层面泌尿相关核团（蓝斑、
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742;R-332

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