神经细胞中MicroRNA-182靶向FOXO3激活Ⅰ型干扰素免疫应答发挥抗人巨细胞病毒作用

发布时间：2020-03-29 20:27

【摘要】：研究背景人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)是疱疹病毒家族的重要组成成员之一,可导致先天性脑组织发育障碍及免疫缺陷人群的脑功能损害。先天性HCMV感染可导致智力低下,视神经萎缩,癫痫等多种中枢神经系统疾病。在免疫功能低下人群中,HCMV感染可引起HCMV相关性脑炎或脑病,造成极高的致残或致死率。脑组织是HCMV感染的主要靶器官之一,在中枢神经系统中HCMV优先感染神经元细胞,然而关于其在神经细胞中复制过程的机制研究甚少。因此,了解HCMV在神经细胞中的复制机制或对预防HCMV所致的神经系统疾病具有重要意义。MicroRNAs(MiRNAs)是一类非编码的小分子RNA,其长度通常约为21-25个核苷酸,可参与调控多种病毒的感染过程。在登革热病毒感染宿主细胞时,miR-146可通过靶向TRAF6来抑制干扰素的表达,以促进登革热病毒在宿主细胞内的复制。流感病毒可导致miR-146a和miR-155的异常表达,从而抑制宿主细胞内Ⅰ型干扰素(IFN)应答。研究发现miRNA-138可参与调控HCMV在内皮细胞的复制过程,然而关于miRNAs对HCMV感染神经细胞的调控研究相对较少,这引起了我们极大的研究兴趣。免疫调节在HCMV感染宿主细胞过程中发挥至关重要的作用。在免疫功能正常人群中,免疫系统可抑制HCMV在宿主细胞内的复制。而在免疫系统尚未发育成熟或免疫功能缺陷人群中,免疫系统并不能有效抑制HCMV的感染过程。此外,HCMV还可诱发机体产生免疫逃逸机制,在宿主体内长期隐匿存在,当机体免疫力下降时,病毒可在宿主细胞内大量复制。由此表明免疫系统参与调控HCMV在宿主细胞内复制过程。因此,我们推测miRNAs或可通过调控机体免疫应答反应激活HCMV在神经细胞内复制过程。研究目的1筛选HCMV感染宿主在神经细胞前后差异表达显著的microRNAs;2研究miR-182在神经细胞上对HCMV复制的影响;3鉴定miR-182作用的靶基因;4分析miR-182在神经细胞上调控HCMV复制的分子机制。研究内容1 microRNA芯片筛选以及miR-182的水平检测;2 miR-182对干扰素免疫应答及HCMV复制的调控;3 miR-182的靶基因预测鉴定及其对miR-182调控干扰素免疫应答及HCMV复制的干预作用;4动物模型中miR-182 agomir对HCMV病毒复制的影响。研究方法1通过分析HCMV感染宿主细胞前后microRNA芯片数据(数据来源GEO数据库,Accession:GSE33584和GSE75305),挑选上调,下调最明显的8条microRNA验证;2 U-251MG,NPCs两株神经细胞在不同感染时间,不同感染浓度对miR-182水平的影响;3在U-251MG,NPCs两株神经细胞中过表达或者干扰miR-182后,检测HCMV拷贝数,病毒滴度以及病毒的两个关键蛋白(IE2与pp65)的表达;4在U-251MG,NPCs两株神经细胞中过表达或者干扰miR-182后,检测内源性IFN-α/β的生成;5将si-IFN-αreceptor I(IFNAR1)和si-IFNAR2转染U-251 MG和NPCs细胞,使IFNAR1与IFNAR2沉默,检测干扰素刺激因子(ISGs)、MxA与OAS1的表达,同时检测HCMV拷贝数与病毒滴度;6采用两种在线软件TargetScan 7.0(targetscan.org/)与miRanda(microrna.org/)预测miR-182的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验对可能作用的靶基因(the fork head box O3,FOXO3)进行验证。在HCMV感染前转染miR-182模拟物到U-251 MG和NPCs中,检测FOXO3及其下游基因IRF7的蛋白表达变化;7靶基因功能研究,通过构建pcDNA-FOXO3过表达质粒,将质粒与miR-182模拟物共同转染细胞进行过表达,检测FOXO3过表达对对miR-182调控干扰素免疫应答及HCMV复制的干预作用;8通过尾静脉将agomiR-182注射到5只小鼠中,使其在小鼠体内过表达,检测miR-182过表达对HCMV在小鼠体内复制的影响。研究结果1 HCMV感染细胞会导致宿主细胞microRNA表达谱的差异,其中miR-182上调变化最为显著。且该效应呈时间剂量依赖。2在U-251MG,NPCs两株神经细胞中,过表达miR-182能够抑制病毒复制,而沉默miR-182的表达上调HCMV滴度。3在U-251MG,NPCs两株神经细胞中过表达miR-182促进I型干扰素免疫应答,而沉默miR-182的表达抑制I型干扰素免疫应答。同时我们发现HCMV感染能够引起ISGs、MxA与OAS1表达上调,而干扰IFNAR1与IFNAR2可以解除这种上调的作用,更重要的是还可以解除miR-182模拟物对病毒复制的抑制作用。4通过两种不同软件,我们发现miR-182的靶基因可能为FOXO3。通过双荧光素酶报告基因试验证实FOXO3为miR-182的靶基因。另一方面,我们还发现在病毒感染情况下,miR-182过表达能够抑制FOXO3的表达,增强IRF7的转录活性。5 miR-182过表达促进干扰素免疫应答,抑制HCMV的复制。但是同时转染pcDNA-FOXO3以后,miR-182的抗病毒功能被抑制。正相反,同时转染si-IRF7后,miR-182的抗病毒功能得到增强。6在动物模型中miR-182过表达同样能够抑制HCMV的复制,且FOXO3和IRF7水平对应调控。研究结论1 HCMV感染神经细胞显著上调miR-182的表达。2神经细胞中miR-182过表达通过上调IFN-α/β的表达,激活下游ISGs、MxA与OAS1的表达,进而抑制HCMV的复制。3神经细胞中miR-182通过靶向抑制FOXO3,上调IRF7从而激活干扰素免疫应答,发挥抗病毒作用。4动物模型中miR-182过表达同样能够抑制HCMV的复制。
【图文】：

第一章 引言因组结构特征因组是所有疱疹病毒中最大的，GC 含量较高。与单纯疱疹的独特序列(Unique Long, UL)和短的独特序列(Unique Sh的两端都带有反向重复序列(TRL, IRL, IRS 和 TRS)（图 1-1毒的基因组可以呈现 4 种形式的同分异构体。相反，，动物 C病毒的基因组是线性的，没有重复区域。UL 和 US 区域的反的直接重复序列(a，b，c)和 UL-US 连接处的反向重复序列(a

第一章 引言3-1;miR-m22-1;miR-M23-2;miR-M44-1;miR-M55-1;miRm59-m59-2;miR-M87-1;miR-m88-1;miR-M95-1;miR-m107-1;miR-1; miRm108-2V 24 miR-r1-1;miR-r1-2;miR-r1-3;miR-r1-4;miR-r6-1;miR-R37-1;m3.1-1;miRr43.1-2;miR-OriLyt-1;miR-OriLyt-2;miRR87-1;miR;miR-R91-1;miR-r95.1-1;miR-r111.1-1;miR-r111.1-2;miR-r11miR-r111.2-1;miR-r111.2-2;miR-r111.2-3;miR-r111.2-4;miR-5;miR-r111.2-6; miR-r170-1
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

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本文编号：2606477