小鼠出生后Ihh敲除导致其四肢短小畸形的现象观察及相关机制的研究

发布时间：2020-04-06 23:07

【摘要】：目的:基于Cre/LoxP系统建立出生后小鼠软骨组织特异性Ihh基因敲除模型,观察其表型变化差异,并从分子层面探讨条件性敲除Ihh基因后小鼠软骨生长板异常骨化的相关机制,为诸如Jensen干骺端发育不良、Laron综合征、骨质疏松、人类Ihh基因突变导致的A1型短指症等疾病的发病机理提供治疗的新思路。方法:(1)通过琼脂糖凝胶电泳对刚出生小鼠进行基因鉴定,筛选适合的基因型小鼠并通过腹腔注射他莫昔芬(tamoxifen TM)实现Ihh条件性基因敲除。通过RT-qPCR验证Ihh基因的敲除率。(2)对8周龄小鼠大体形态进行观察并记录,拍摄全身及后肢X线片,利用Micro-CT对小鼠膝关节行断层扫描并三维重建,观察其骨质疏松程度;选取6d、8d、10d、12d小鼠膝关节行番红固绿染色、Von Kossa染色进行软骨生长板动态演变观察。(3)选择出生后第6天小鼠肋软骨细胞提取并体外培养,流式细胞学法探讨软骨生长板异常骨化原因,RT-qPCR检测围绕Ihh-PTHrP信号轴相关信号因子的表达并运用细胞营救实验进行验证,以此解析下游相关基因。结果:(1)通过RT-qPCR证实了Ihh条件性基因敲除率为76.83%。(2)8周龄小鼠大体形态表现为肢体短小畸形,且差异有统计学意义(P0.01),实验组小鼠存在着明显的骨质疏松(P0.05),X线及Micro-CT三维重建显示敲除小鼠股骨、胫骨明显缩短且骨骺端发育异常;番红固绿染色显示Ihh条件性敲除表达在发育中的小鼠胫骨生长板软骨组织这一特定区域,Von Kossa染色显示Ihh~(d/d)小鼠生长板提前出现骨化并且骨骺过早闭合。(3)凋亡实验表明两组差异无统计学意义(P0.05);RT-qPCR表明,条件性敲除Ihh后,PTHrP表达量降低(P0.05),BMP-6表达明显升高(P0.05),RunX-2的表达差异无统计学意义(P0.05);细胞营救实验同时验证了这一结果。结论:Ihh基因对维持小鼠生长板区软骨细胞的有序分区及程序化分化有着相当重要的作用,Ihh条件性基因敲除后导致小鼠生长板区软骨细胞分化无序,分区紊乱,生长板区软骨细胞提前骨化,骨骺生长板过早骨化闭合,小鼠表现为肢体短小畸形并伴有明显的骨质疏松;围绕Ihh-PTHrP信号轴,Ihh的敲除抑制了其下游基因PTHrP的表达却促进了BMP-6表达,暂未发现与RunX-2信号因子相关关系。
【图文】：

图 2.1 基因型小鼠琼脂糖凝胶电泳鉴定1 号小鼠不含 Cre 基因，Ihh 为野生型杂合子；2 号小鼠不含 Cre，Ihh 为纯合子；3 号小鼠基因，Ihh 为纯合子，可作为实验小鼠；4 号小鼠含 Cre 基因，Ihh 为野生型杂合子。2.2 通过 RT-qPCR 检测到 Ihh 基因的敲除率RT-qPCR 结果显示，，Ihh 的基因敲除率为 76.83%。如图 2.2 所示。

图 2.1 基因型小鼠琼脂糖凝胶电泳鉴定因，Ihh 为野生型杂合子；2 号小鼠不含 Cre，Ihh 为纯合子合子，可作为实验小鼠；4 号小鼠含 Cre 基因，Ihh 为野CR 检测到 Ihh 基因的敲除率显示，Ihh 的基因敲除率为 76.83%。如图 2.2 所示
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R-332;R722.1

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