弓形虫ROP16蛋白影响小鼠子宫蜕膜化间质-上皮转化的分子机制研究

发布时间：2020-04-08 04:33

【摘要】：背景:刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种属于真球虫目(Eucoccidiorid)、弓形虫科(Toxoplasmatidae)、弓形虫属(Toxoplasma)的专性细胞内寄生原虫,根据虫体对小鼠毒力的差异可以将弓形虫分为3型。弓形虫的先天性垂直传播则是导致不良妊娠结局的重要致畸因子之一。弓形虫可以经胎盘侵犯胎儿,在孕后不同时期感染导致严重后果。当前研究弓形虫引发异常妊娠的机理多集中在免疫学角度,而弓形虫与胚胎发育过程相关细胞的相互作用研究相对较少。弓形虫完成宿主细胞内生活过程所分泌释放的多种蛋白具有调节宿主细胞功能的作用。例如弓形虫ROP18和GRA15均可通过宿主细胞NFκB影响宿主细胞的基因表达。弓形虫ROP16蛋白同样在不同虫株间存在多态性。I型和III型虫株(如RH,CTG)ROP16_(I/III)蛋白可以通过直接和宿主细胞的Stat3结合,磷酸化Stat3的705位的酪氨酸。弓形虫蛋白ROP16可以磷酸化宿主细胞的转录因子Stat3,并且部分抑制宿主细胞凋亡,抑制细胞分化。而动物妊娠早期胚胎着床的EMT现象也有Stat 3的参与,并且伴有细胞的增殖、分化。目的:从细胞凋亡和MET两个方面研究弓形虫蛋白ROP16对小鼠妊娠的影响,揭示ROP16的互作蛋白,阐明ROP16引发小鼠不良妊娠的分子机理。方法:体外实验部分主要通过培养小鼠妊娠的子宫基质细胞,并将其转染重组ROP16_(I/III)慢病毒,用流式细胞术、Western blotting和Real-Time PCR的方法检测细胞凋亡比率、细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达水平;体外验证ROP16_(I/III)在小鼠蜕膜化过程中对MET的影响:培养小鼠妊娠第四天的子宫基质细胞,诱导其蜕膜化,转染。用Western blot和Real-Time PCR的方法检测MET相关的标志分子Vimentin、E-cadherin和转录因子的表达变化,检测细胞凋亡相关蛋白的表达和转录情况。体内实验主要是通过慢病毒转染的方法将ROP16_(I/III)体内注射到妊娠期第4天的小鼠子宫,取第8天小鼠子宫,体外将着床位点的组织分离,提取RNA或蛋白,用Real-Time PCR或Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达水平。免疫组化检测着床位点的细胞凋亡水平;体内验证ROP16_(I/III)蜕膜化的影响:观察其妊娠率、胚胎着床数目,称量蜕膜组织的重量。另外将着床位点的组织分离,提取RNA或蛋白,用Real-Time PCR或Western blot检测MET相关的标志分子和转录因子。结果:(1)提取的小鼠子宫基质细胞纯度为(95±2.5)%,在体外诱导蜕膜化后,PRL mRNA的表达随时间增长而显著升高(p0.05)。(2)在诱导蜕膜化的蜕膜细胞中过表达ROP16,细胞流式术结果显示:相比于对照组,ROP16慢病毒转染组蜕膜细胞的凋亡率降低(p0.05),蜕膜细胞凋亡蛋白BAX表达明显降低,BCL-2蛋白表达上调。(3)在诱导蜕膜化的蜕膜细胞中过表达ROP16,运用qRT-PCR对各组细胞的ZEB1、E-Cadherin和Vimentin的mRNA进行定量研究,结果显示:相比于对照组,ROP16转染组的ZEB1和Vimentin的mRNA表达升高(p0.05),而E-Cadherin的mRNA表达降低。(4)小鼠怀孕第4天,子宫角注射ROP16慢病毒或空载慢病毒阴性对照,待第8天取出小鼠子宫,观察小鼠胚胎着床数量,结果显示:相对于对照组,ROP16转染组的小鼠子宫胚胎着床率显著下降(p0.05)。(5)取上述步骤的第8天子宫模型,免疫组化检测Bax、Bcl-2的表达及分布,结果与Western blot结果一致。结论:蜕膜化过程中,弓形虫ROP16蛋白会抑制蜕膜细胞的凋亡,可能会影响蜕膜细胞增殖与凋亡的平衡从而影响胚胎的植入。同时,在蜕膜化过程中。ROP16蛋白会影响子宫基质细胞的MET。实验结果表明,在着床前期的孕鼠子宫经子宫角注射ROP16慢病毒后,胚胎着床率会显著降低,说明了弓形虫ROP16蛋白会通过影响孕鼠子宫内蜕膜化进程而导致不良妊娠结局。
【图文】：

基质细胞,荧光显微镜,波形蛋白,标志物

图 1 小鼠子宫内膜基质细胞的鉴定（×200）Figure 1Identification of purity of mouse endometrial cell(A)荧光显微镜下观察基质细胞标志物 Vimentin 蛋白。（B）荧光显微镜下观察 DAPI 染色的细胞核。（C）合并观察计数波形蛋白阳性细胞数与细胞总数。

蜕膜化,基质细胞,明场,子宫

图 2 小鼠子宫基质细胞体外诱导蜕膜化(x200)Figure 2 Decidualization of stromal cells induced with P4,E2 plus cAMP treatment(A)明场下观察小鼠子宫基质细胞。(B)经过体外诱导蜕膜化后，明场下观察蜕膜细胞。(C) 小
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R382.5

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