衣原体分泌蛋白cHtrA抑制LL-37抗衣原体活性的研究

发布时间：2020-04-14 03:50

【摘要】：目的:对比LL-37、HNP1、HNP3、HBD2、HBD4对沙眼衣原体的IC50;检测体外原核表达的衣原体高温需要A蛋白(cHtrA)酶切上述5种抗菌肽的能力;检测内源性cHtrA酶切LL-37的能力;检测外源性cHtrA及其突变型(MT-H143A和MT-S247A)抑制LL-37杀伤沙眼衣原体L2型、D型、鼠肺炎株(MoPn)的能力。方法:体外培养HeLa细胞,以2.0?10~5/ml的细胞浓度接种至24孔板内,待细胞密度增长至90%时接种与5种抗菌肽共孵育过的沙眼衣原体L2型菌株,37℃温箱培养,利用间接免疫荧光对5种抗菌肽进行IC50滴定;将5种100μg/ml的抗菌肽分别与0μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml四种浓度的外源性cHtrA以及两种100μg/ml的突变型cHtrA MT-H143A和cHtrA MT-S247A在37℃孵箱中孵育30分钟,经SDS-PAGE跑胶后用Western Blot检测cHtrA与抗菌肽之间的相互作用结果;沙眼衣原体L2型菌株感染HeLa细胞后提取其细胞胞浆(L2S100),并以免疫共沉淀的原理,通过谷胱甘肽蛋白珠提取L2 S100中的内源性cHtrA,使不同量的内源性cHtrA与LL-37共孵育后,经SDS-PAGE跑胶后用Western Blot检测内源性cHtrA对LL-37的酶切作用;将LL-37与不同浓度的外源性cHtrA以及2种突变型cHtrA MT-H143A和MT-S247A在37℃孵箱中共孵育30min,每组再与沙眼衣原体L2型菌株、D型菌株和鼠肺炎株(MoPn)在室温下共孵育2h,经感染HeLa细胞后用免疫荧光检测菌株的感染率;每个盖玻片计数5个随机视图,并求其平均值来定量衣原体感染,结果表示为每个视图的包涵体形成单位(inclusion forming units,IFUs)的数量,基于所设定的每种抗菌肽的浓度梯度,及该浓度下所观察到的IFUs,利用IBM SPSS Statistics 24软件进行数据分析,可得出每种抗菌肽的50%抑制浓度,感染率用(IFUs/细胞数量)表示,每组设置三个相同实验条件的孔同时操作以减少实验误差,经过重复计数及计算,最终感染率表示为(平均值?标准差)。结果:5种人体抗菌肽之中LL-37的抗衣原体作用最强(IC50=4.62?0.94μg/ml;平均值?标准差),其次为HBD2(IC50=28.33?9.45μg/ml),HBD4(IC50=47.7?6.15μg/ml),HNP1(IC50=60.67?5.13μg/ml),HNP3(IC50=69.87?7.45μg/ml)。无论内外源性,10μg/ml cHtrA可以显著且特异的酶切LL-37,而对HNP1,HNP3,HBD2和HBD4毫无影响,100μg/ml的cHtrA可以完全酶切100μg/ml的LL-37底物,两种突变型cHtrA MT-H143A和MT-S247A则失去了该作用。空白对照组的HeLa细胞沙眼衣原体L2型感染率为(54%?6.24%),加入30μg/ml LL-37时衣原体感染率为(7.67%?2.08%),而加入1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml cHtrA时感染率分别为(11.3%?3.51%)、(28.7%?7.51%)、(44.7%?5.13%),仅加入cHtrA未加入LL-37时(47%?6.24%),分别加入cHtrA突变型MT-H143A和MT-S247A时感染率为(10%?3%)、(8.67%?3.06%)。对沙眼衣原体D型、鼠肺炎株(MoPn)进行的实验表现出一致性,且cHtrA浓度加至10μg/ml时感染率均与仅加入LL-37组表现出统计学差异(均有P0.05),两种突变型cHtrA对于对抗LL-37的作用没有意义。结论:LL-37在本试验的五种抗菌肽中表现出了最强效的抗衣原体作用,但无论内源性还是外源性cHtrA均具有酶切LL-37的能力。无论是在沙眼衣原体L2型、D型、还是鼠肺炎株(MoPn),cHtrA均强效抑制LL-37对沙眼衣原体的杀伤作用,该作用随着cHtrA的浓度梯度而逐步增强。这证明了cHtrA在沙眼衣原体感染过程中通过酶切LL-37表现出的正向保护作用。
【图文】：

天津医科大学硕士学位论文验中证明具有最强抗衣原体作用的 Cathelicidin 家族的 LL-37 受到了 cHtrA 特异性的反击。而本实验设置的两组突变型 cHtrA 却均不具备酶切任意一种抗菌肽的能力，因此我们推测，cHtrA 对 LL-37 的酶切作用并非单单是由其某个基团完成的，而是 cHtrA 本身具有此种酶切能力。（见图 2.1）

天津医科大学硕士学位论文后 cHtrA 出现强表达带，而 LL-37 的条带很弱，与加入 15μl提纯的 cHtrA 时条带深浅相当。当 LL-37 中加入粘附有 cHtrA 的谷胱甘肽蛋白珠共孵育后，依照浓度梯度（5μl、15μl、45μl）cHtrA 的条带逐步增强，LL-37 的条带依次减弱直至几乎完全消失（见图 2.2）。此实验进一步验证了 2.2.1 中“cHtrA 可以有效酶切 LL-37”的结论，证明了含有 cHtrA 的细胞胞浆与从中提纯的内源性 cHtrA 均可随着浓度的增加而愈发有效的酶切抗菌肽 LL-37。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R374

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本文编号：2626839