基孔肯雅病毒CHIKV和尼帕病毒NiV病毒样颗粒的构建和免疫原性研究

发布时间：2020-04-14 10:55

【摘要】：疫苗作为一种预防性或治疗性的生物制品,越来越受到人们重视。在分类上,疫苗可分为传统的灭活疫苗、减毒活疫苗和新型的基因工程疫苗。本文所研究的病毒样颗粒疫苗VLPs即为一种基因工程疫苗,因该疫苗不含有病毒核酸,但可以刺激机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫反应,具有很高的安全性和较强的免疫原性。本论文成功构建并获得了表达两种烈性传染病病毒基孔肯雅病毒和尼帕病毒结构蛋白的重组杆状病毒,用重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,经过一系列纯化:浓缩、超离、脱糖等步骤获得了基孔肯雅病毒和尼帕病毒的病毒样颗粒VLPs。该研究工作为两种病毒VLPs疫苗的研发和生产奠定了基础。本论文共分为四章:第1章:前言。本章主要介绍了病毒样颗粒疫苗的发展历程及各种表达系统,包括原核的大肠杆菌表达系统、真核的酵母细胞表达系统、应用广泛的昆虫-杆状病毒表达系统、具有良好翻译后修饰的哺乳动物细胞表达系统和植物生物反应器系统。病毒样颗粒VLPs疫苗作为一种新型疫苗,有其独特优势,也有很多不足之处,在本章,我们具体介绍了每种表达系统的优点和缺点,并对基孔肯雅病毒CHIKV和尼帕病毒NiV疫苗的研发进展做了总结。第2章:基孔肯雅病毒CHIKV VLPs的构建。利用当前应用广泛且便于大规模生产的昆虫细胞-杆状病毒表达系统,构建出并经过一系列鉴定获得了正确的含有基孔肯雅病毒完整结构蛋白的重组杆状病毒,并将重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞系,通过一系列实验,包括SDS-PAGE、Western blotting、免疫荧光IFA和透射电镜等方法确定了基孔肯雅病毒结构蛋白的表达和病毒样颗粒的形成。颗粒形态和大小与野生型基孔肯雅病毒相似。通过将重组杆状病毒感染Sf9悬浮细胞,利用蔗糖密度梯度离心成功纯化出基孔肯雅病毒的病毒样颗粒VLPs。第3章:基孔肯雅病毒CHIKV VLPs免疫原性研究。免疫小鼠,通过分离小鼠血清和小鼠脾细胞,分别检测免疫前后小鼠体内特异性抗体的变化以及细胞因子的含量,以检测病毒样颗粒的免疫原性。第4章:尼帕病毒NiV VLPs的构建。通过利用昆虫-杆状病毒表达系统,成功构建并获得了含有尼帕病毒基质蛋白M、融合蛋白F和糖蛋白G的两种重组杆状病毒。与前面研究基孔肯雅病毒相似,我们同样通过实验检测蛋白表达,确定VLPs的形成;通过大量表达VLPs,负染后电镜观察,可以观察到尼帕病毒的病毒样颗粒。第5章:展望。本章主要分析病毒样颗粒疫苗的研究进展及未来发展方向。
【图文】：

基孔肯雅病毒 CHIKV 和尼帕病毒 NiV 病毒样颗粒的构建和免疫原性研究注意：纯化的病毒样品进行免疫电镜观察时浓度不宜过高，必要时需进理后才能进行吸附。浓度过高或不经脱糖处理可能导致镍网膜破碎影响和电镜观察。抗体稀释度需根据抗体纯度和效价进行调整。 实验结果.1 抗体的制备为了制备检测用抗体，我们成功构建了含有基孔肯雅病毒 CHIKV 结构粒，并经诱导表达，获得了抗原蛋白。其中，，由于 C 片段全长未表达 C 片段截短为两部分，C1 大小为 471 b（p8-164 aa），C2 大小为 615 bp（57。结果如图 1.1-1.4 所示：

结果如图 1.1-1.4 所示：图 1.1 原核表达 pET28a-CHIKV E1 的 SDS-PAGE 和 Western blot 检测结果Figure 1.1 SDS-PAGE and Western blot results of prokaryotic expression ofpET28a-CHIKV E1M:Maker; NC: Negative control; In: Whole bacterial solution; Su:Supernatant; IB:Inclusion body. The protein size is 53 kDa, mainly in the form of inclusion bodies. Theprimary antibody is an antibody against LT-tag in a ratio of 1:5000.
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392-33

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本文编号：2627222